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Nov 02, 2023

Pruebas rápidas de susceptibilidad a antibióticos e identificación de especies para muestras mixtas

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 6215 (2022) Citar este artículo 10k Accesos 7 Citas 22 Detalles de Altmetric Metrics La resistencia a los antimicrobianos es un problema creciente a nivel mundial

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 6215 (2022) Citar este artículo

10k Accesos

7 citas

22 altmétrica

Detalles de métricas

La resistencia a los antimicrobianos es un problema creciente a escala mundial. Se necesitan con urgencia pruebas rápidas de susceptibilidad a los antibióticos (AST) en la clínica para permitir prescripciones personalizadas en entornos de alta resistencia y limitar el uso de medicamentos de amplio espectro. Los métodos actuales de AST fenotípico rápido no incluyen la identificación de especies (ID), lo que deja el cultivo en placas o cultivos que requieren mucho tiempo como la única opción disponible cuando se necesita la identificación para realizar la llamada de sensibilidad. Aquí describimos un método para realizar AST fenotípico a nivel unicelular en un chip de microfluidos que permite el genotipado posterior mediante FISH in situ. Al estratificar la respuesta fenotípica de AST en las especies de células individuales, es posible determinar el perfil de susceptibilidad para cada especie en una muestra mixta en 2 h. En este estudio de prueba de principio, demostramos el funcionamiento con cuatro antibióticos y muestras mixtas con combinaciones de siete especies.

El rápido aumento de la resistencia a los antibióticos es una grave amenaza para la salud humana; El acceso a antibióticos eficaces es una piedra angular de la medicina moderna y un requisito previo para, por ejemplo, el tratamiento del cáncer y la cirugía. Diferentes investigaciones1,2 hacen diferentes estimaciones sobre la gravedad de la situación, pero hay consenso en que es necesario tomar medidas o los costos, tanto en términos de sufrimiento humano como de impacto económico global, serán asombrosos3. Los expertos también coinciden en que el problema se debe, al menos en parte, al uso indiscriminado y mal utilizado de una amplia gama de antibióticos4. Para superar este problema, se necesitan pruebas de susceptibilidad a los antibióticos (AST) rápidas y personalizadas, idealmente en el lugar de atención5. Sin estas herramientas, a los médicos no les queda otra opción que prescribir antibióticos de amplio espectro en muchos casos, ya que puede llevar varios días identificar los patógenos y el perfil de resistencia.

Las limitaciones de los AST fenotípicos convencionales (dilución en agar por difusión en disco o microdilución en caldo) son que requieren crecimiento bacteriano durante períodos prolongados en presencia y ausencia de antibióticos para ver un efecto. Sin embargo, para ciertos tipos de infecciones bacterianas, incluso un retraso de 6 horas antes de iniciar el tratamiento puede tener consecuencias graves6. Un ejemplo de ello es la sepsis, donde se estima que el riesgo de muerte aumenta un 7,6% por cada hora que no se administra un tratamiento eficaz7. Además, se ha demostrado que, en ausencia de AST rápida, más del 25 % de los pacientes sépticos fueron tratados por médicos con antibióticos inadecuados, lo que está fuertemente asociado con la mortalidad8,9,10. Por tanto, se necesitan AST rápidos y precisos para salvar vidas. Pero teniendo en cuenta los aumentos de la resistencia a los antimicrobianos, las enfermedades potencialmente mortales no son las principales culpables, sino más bien el uso masivo de antibióticos para enfermedades más benignas11. El agotamiento de los antibióticos eficaces también se debe a la estrategia de cambiar los antibióticos de primera línea cuando la prevalencia de resistencia local ha alcanzado aproximadamente el 10-20%. Si fuera posible acceder a AST rápidos y fiables, se podrían utilizar antibióticos de alta resistencia para entre el 80% y el 90% de las infecciones que aún son susceptibles.

La evidente necesidad y los beneficios de la AST rápida, tanto para salvar vidas como para orientar las prescripciones, han dado lugar al desarrollo de varios métodos nuevos durante la última década. Estos métodos se describen en varias revisiones recientes, por ejemplo, 4, 12, y no repetiremos aquí todos los pros y los contras de los diferentes métodos. Brevemente, estos métodos se pueden dividir en dos categorías, genotípicos y fenotípicos. Los métodos genotípicos identifican marcadores genéticos específicos asociados con la resistencia a los antibióticos. Aunque estos métodos pueden detectar rápidamente la presencia de genes de resistencia específicos, dependen de nuestro conocimiento de los mecanismos de resistencia, que está lejos de ser completo13, en particular considerando la rápida aparición de nuevos mecanismos de resistencia. Además, la ausencia de genes de resistencia no predice la susceptibilidad a los antibióticos14, es decir, uno puede aprender qué no usar pero no qué funcionará. En los métodos fenotípicos, las bacterias se exponen a un antibiótico y se controla su respuesta fenotípica, por ejemplo, lisis o reducción de la tasa de crecimiento. Los métodos fenotípicos funcionan independientemente del mecanismo de resistencia. Si la respuesta fenotípica está presente, la bacteria es susceptible. Los diversos AST fenotípicos rápidos que han llegado al mercado pueden brindar una respuesta (susceptible o resistente) en 2 a 6 h para hemocultivos positivos que han estado creciendo >6 h desde la toma de muestras del paciente. Para otras muestras, por ejemplo, orina, el tiempo de respuesta se puede reducir a 30 minutos para especies gramnegativas cargando la muestra directamente en un microchip y midiendo la tasa de crecimiento con y sin antibióticos15.

Una limitación de todos los métodos rápidos de AST fenotípico es que sólo funcionan si se conocen las especies de bacterias. La identificación detallada de las especies no es necesaria para infecciones con un espectro estrecho de patógenos16, pero para la sepsis y otras infecciones más complejas, es esencial. La especificación de masas MALDI-TOF es actualmente el estándar de oro para la determinación de especies17. Sin embargo, MALDI-TOF aún requiere un cultivo previo de una sola especie bacteriana y puede no funcionar bien para infecciones mixtas que se observan comúnmente en sepsis, heridas, infecciones urinarias asociadas a catéteres18 y neumonía adquirida en la comunidad, entre otras19. El desafío sigue siendo hacer AST fenotípico rápido con identificación de especie.

Para abordar este problema, utilizamos un chip de microfluidos para capturar rápidamente bacterias individuales de una muestra y monitorear ópticamente su crecimiento con y sin antibióticos. A continuación, identificamos las especies bacterianas mediante hibridación fluorescente in situ (FISH) con sondas de ADNss específicas de cada especie dirigidas a la secuencia de ARNr 16s/23s. Una vez que tenemos la ID de especie y la respuesta de AST para cada bacteria en el chip de microfluidos, estratificamos la respuesta de AST según la especie, lo que implica que podemos tener muestras con especies mixtas. En la figura 1 se presenta una descripción esquemática del enfoque.

a Una caricatura de la configuración de microfluidos con las especies mixtas cargadas en el chip. b Imágenes de contraste de fase en lapso de tiempo de las células en las trampas cuando se cultivan en medios con (arriba) y sin antibióticos (abajo). c Imágenes de fluorescencia de las bacterias con sondas de ADNss dirigidas al ARN ribosómico de bacterias específicas para la identificación de especies. d Análisis de pilas de lapso de tiempo e identificación de especies utilizando aprendizaje profundo para segmentar y rastrear células. e Detección de perfiles de AST para patógenos individuales a una concentración de antibiótico determinada. Parte de la Fig. 1a creada con www.biorender.com.

En esta prueba de aplicación de principio, realizamos las AST para siete patógenos comunes (Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis y Acinetobacter baumannii, como ejemplos de cepas gramnegativas, y Enterococcus faecalis y Staphylococcus aureus como ejemplos de gram -positivos). Probamos cuatro antibióticos diferentes de diferentes clases: vancomicina (Van) [glucopéptido], ciprofloxacina (CIP) [fluoroquinolonas], gentamicina (Gen) [un aminoglucósido] y nitrofurantoína (NIT) [otros agentes]. Finalmente, mostramos cómo el etiquetado multicolor de una sola ronda permite la identificación de hasta diez especies simultáneamente.

El chip de cultivo que hemos desarrollado para este ensayo es capaz de capturar rápidamente bacterias directamente de una muestra líquida y permite el monitoreo óptico del crecimiento bacteriano con y sin antibióticos en tiempo real. El mismo diseño de chip se ha utilizado anteriormente para capturar bacterias de hemocultivos a pesar de un abrumador exceso de células sanguíneas20. El chip presenta dos filas de trampas de 3000 células cada una. Cada trampa mide 1,25 × 1,25 × 50 μm15 y tiene una constricción en el extremo que evita que las bacterias escapen de la trampa y al mismo tiempo permite que los medios y las sondas fluyan alrededor de las células. Para simular una situación de infección mixta, se diluyeron cultivos bacterianos durante la noche de varias especies diferentes en un caldo Mueller Hinton (MH), se combinaron y se cargaron directamente en el chip de microfluidos. En un experimento típico, cargar una o unas pocas células en cada trampa tarda 1 minuto a ~105 UFC/ml. Suministramos medios de crecimiento con antibióticos a las trampas en una de las dos filas y medios de crecimiento simples en la otra.

La respuesta fenotípica al antibiótico se determinó en aproximadamente 60 minutos capturando imágenes de contraste de fase de 100X de cada célula cada 2 minutos y calculando las tasas de crecimiento de las células individuales en ventanas deslizantes de 10 minutos. La respuesta fenotípica se puede reducir a tiempos más cortos dependiendo de qué antibióticos se utilicen y en qué concentración15. Para identificar las especies de cada célula bacteriana, realizamos hibridación fluorescente in situ (FISH) utilizando sondas de ADNss fluorescentes específicas de cada especie. Estas sondas (Datos complementarios 1) se unen a las abundantes secuencias de ARN ribosómico 16s/23s y se han utilizado previamente con éxito para la identificación de especies en hemocultivos positivos21. El método de clasificación de especies para señales FISH se describe en el método SI 3.

Realizar análisis de tasas de crecimiento en muestras de múltiples especies requiere un método general para detectar y rastrear células que tienen diferentes formas y tamaños. En Delta 2.022, se utilizó un U-net23 para predecir mapas de células versus fondo de imágenes de contraste de fase y mostró un rendimiento excelente para células de E. coli, tanto en dispositivos similares a máquinas madre como en almohadillas de agarosa. Algoritmos más generales para la segmentación celular, como Cellpose24 y su sucesor Omnipose25, construyen identidades celulares a partir de campos intermedios (Fig. 2a) aprendidos mediante una red neuronal convolucional, similar a una U-net. Se demostró que Omnipose realiza la segmentación de células bacterianas independientemente de su morfología. Los enfoques que calculan las identidades de las celdas (Cellpose, Omnipose) asignan diferentes etiquetas únicas a las celdas que comparten un límite, mientras que los enfoques de celda versus fondo (U-net) no se pueden usar para separar celdas que comparten un límite. Los primeros enfoques requieren etiquetas de celda como datos de entrenamiento, mientras que el segundo solo necesita máscaras binarias.

una red omnipose que muestra la estructura de la red, las entradas y salidas de la red neuronal y la reconstrucción de la salida para generar máscaras celulares. b Rendimiento cuantificado de la segmentación celular en dispositivos de máquina madre. Gráfico de precisión promedio versus umbral de pagaré para un conjunto de datos de especies mixtas. El umbral IOU define una coincidencia válida entre la máscara predicha y las máscaras de verdad del terreno, 0,5 indica que la mitad de los píxeles coincidieron correctamente y 1 indica una coincidencia perfecta de píxeles para cada celda. La precisión promedio (TP/(TP + FP + FN)) se calcula a partir de las coincidencias válidas (TP), las no válidas (FP) y las máscaras de verdad sobre el terreno que no tienen ninguna coincidencia válida (FN). c Pocos ejemplos de imágenes de contraste de fase, verdades fundamentales y predicciones de red de U-net y Omnipose. d Descripción general de la red de rastreadores. e Matriz de confusión de las predicciones de bordes. f Pistas de células en un canal del dispositivo de la máquina madre.

Se creó un conjunto de datos de entrenamiento reales (82 imágenes) de células mixtas que crecen en dispositivos de máquina madre con supervisión humana utilizando la herramienta LabelsToROIs26 y scripts personalizados (método SI 1). Utilizamos un modelo Omnipose entrenado con estos datos para la segmentación celular. El entrenamiento y el rendimiento de Omnipose y U-net también se describen en el método SI 3. El rendimiento en tiempo de ejecución de los pasos de reconstrucción de las salidas de la red Omnipose se mejoró dos veces (SI Fig. 1b). Omnipose mostró un rendimiento superior (Fig. 2b) en datos de especies mixtas en comparación con una red U entrenada para predecir máscaras binarias. Demostramos que el omnipose funcionó igualmente bien en datos de especies mixtas que en datos de cultivos puros de E. coli (SI Fig. 1b, e); el rendimiento de U-net, por otro lado, dependía de la especie. La Figura 2c muestra imágenes de contraste de fase, sus correspondientes verdades fundamentales y células detectadas utilizando los enfoques Omnipose y U-net, respectivamente.

Enfoques anteriores para el seguimiento exitoso de E. coli han construido linajes celulares utilizando mecanismos de puntuación basados ​​en regiones superpuestas27 o predicciones de máscara binaria madre-hija utilizando todas las características de las imágenes22. El primer enfoque es muy sensible al ajuste de parámetros de superposición, mientras que el segundo es computacionalmente costoso cuando hay muchas celdas pequeñas presentes en los datos. Inspirándonos en los desarrollos recientes en el uso de redes siamesas28 y formulaciones de gráficos29 para el seguimiento general de objetos, ahora hemos desarrollado un enfoque que realiza el seguimiento celular utilizando una red que compara las propiedades celulares entre dos marcos y predice la presencia y el tipo de conexiones, por ejemplo, crecimiento celular. o evento de división (Fig. 2d). Los datos de entrenamiento para esta red se obtuvieron utilizando un simulador (método SI 4) que simula células de diversos tipos y tasas de crecimiento que crecen en los canales de la máquina madre. El entrenamiento de la red de seguimiento se describe en la Información complementaria (método SI 4). En la Fig. 2e, mostramos la matriz de confusión del modelo utilizado para rastrear datos experimentales evaluados en 100 pilas de series de tiempo generadas aleatoriamente. Antes de construir las pistas, se eliminaron los enlaces que tienen aumentos abruptos de áreas ya que corresponden a eventos de fusión causados ​​por errores de segmentación (método SI 4). La Figura 2f (izquierda) muestra una trampa de máquina madre segmentada única rastreada a través del tiempo con vínculos de crecimiento/movimiento (rojo) y vínculos de división (azul). La asignación de especies a pistas según la identificación de especie identificada en el último cuadro se realizó después del seguimiento celular (método SI 5).

Con la ID de especie y la respuesta de AST para cada célula en el chip de microfluidos, se pudo determinar la respuesta de AST específica de la especie en las muestras mixtas. Aquí, primero demostramos la capacidad del método para caracterizar una muestra mixta de cuatro especies diferentes, aunque es más probable que las muestras de pacientes clínicos contengan solo una o dos30,31,32. Las respuestas de AST se muestran en las figuras 3a a d. En cada experimento, obtuvimos curvas de crecimiento-respuesta para tres cepas gramnegativas (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa) y una cepa grampositiva (Enterococcus faecalis). Los experimentos se realizaron con cuatro antibióticos diferentes: vancomicina (Van) [glucopéptido], ciprofloxacina (CIP) [fluoroquinolonas], gentamicina (Gen) [un aminoglucósido] y nitrofurantoína (NIT) [otros agentes]. Presentamos los resultados como gráficos de respuesta de experimentos individuales para simular la situación de la muestra clínica. A modo de comparación, también mostramos las respuestas promedio que habrían sido el resultado de las mediciones de la tasa de crecimiento sin información de las especies. Se logró un perfil AST exitoso con muestras que contenían tan solo 100 bacterias/especies. Usamos bacterias sin genes de resistencia específicos, pero dado que algunas especies tienen una resistencia natural a antibióticos específicos, la respuesta de AST varió según la especie. Por ejemplo, las especies de Pseudomonas son naturalmente resistentes a la ciprofloxacina (Fig. 3a) y a la nitrofurantoína (Fig. 3b), y su crecimiento no se vio afectado en presencia de 1 μg/ml de ciprofloxacina o 32 μg/ml de nitrofurantoína. La tasa de crecimiento de las otras especies bacterianas cayó más del 10% en 30 minutos en presencia de estos fármacos. Es importante destacar que, a partir de los datos promedio no estratificados por especies, vemos que sin acceso a la identificación de especies, no habríamos podido detectar Pseudomonas resistentes en la población mixta. De manera similar, como se esperaba, se encontró que todas las especies, excepto E. faecalis, eran susceptibles a la gentamicina (2 μg/ml) (Fig. 3c) y resistentes a la vancomicina (4 μg/ml) (Fig. 3d).

Perfiles a – d AST con tasas de crecimiento normalizadas para los cuatro antibióticos utilizados. Para cada antibiótico se muestran las respuestas estratificadas por especies (media y SEM), así como la respuesta agrupada (sin estratificación por especies). En todos los gráficos del perfil AST, S y R representan Susceptibilidad y Resistencia, respectivamente. El experimento se realiza una vez por antibiótico, aunque se realizaron varios experimentos no informados para la calibración.

Se estima que >90% de las muestras de sepsis clínica presentan un subconjunto de los 10 patógenos bacterianos más frecuentes33. Para aumentar la cantidad de especies que podemos identificar, realizamos FISH combinatoria utilizando un adaptador específico de especie que puede unir dos oligosondas fluorescentes diferentes. Con sondas de cuatro colores diferentes, esta configuración puede identificar hasta 10 especies (Fig. 4a). Demostramos el enfoque combinatorio FISH identificando siete especies cargadas en el chip de cultivo (Fig. 4b). La combinación de señales por especies utilizando todos los adaptadores y sondas se muestra en la Fig. 7 de SI. La clasificación de especies se realizó utilizando un clasificador de bosque aleatorio en la señal 4-d obtenida al apilar imágenes de cuatro canales de fluorescencia (método SI 6). Para demostrar los perfiles de AST por especies utilizando FISH combinatorio, realizamos experimentos con combinaciones de dos especies tratadas con diferentes antibióticos (Fig. 5). Por ejemplo, cuando Escherichia coli y Enterococcus faecalis se trataron con vancomicina (4 μg/ml), las dos especies mostraron perfiles de tasa de crecimiento claros y distinguibles correspondientes a resistencia y susceptibilidad, respectivamente (Fig. 5d). Las repeticiones de estos experimentos se muestran en las figuras 5e – h.

a Descripción general del sondeo combinatorio FISH para la identificación de múltiples especies. Una caricatura que ilustra las diferentes especies bacterianas con su ARN ribosómico (izquierda). Ilustración de las secuencias específicas con los múltiples adaptadores dirigidos al ARN ribosómico de bacterias individuales y su hibridación con el ARNr objetivo (centro). Sondas de detección con diferentes fluoróforos. Hibridación de sondas de detección con las secuencias adaptadoras junto con secuencias únicas que están dirigidas al ARNr específico de la especie (derecha). b Imágenes de ejemplo (barra de escala de 20 µm) de especies mixtas cargadas en el chip de microfluidos y sondadas utilizando FISH combinatorio para la identificación de especies. Después del paso de hibridación, se tomaron imágenes de las células en diferentes canales (PhC, Alexa 488, Cy3, Cy5 y Texas Red). Las especies bacterianas están marcadas en blanco (Escherichia coli), magenta (Klebsiella pneumoniae), cian (Pseudomonas aeruginosa), marrón (Enterococcus faecalis), amarillo (Acinetobacter baumannii), azul marino (Proteus mirabilis) y rojo (Staphylococcus aureus). El experimento con las siete especies mezcladas se realizó una sola vez. Sin embargo, en la Fig. 5 se informan experimentos similares con todos los adaptadores y sondas mezclados.

a P. aeruginosa y A. baumannii fueron tratados con gentamicina, b K. pneumoniae y S. aureus tratados con ciprofloxacina, c E. coli y P. mirabilis tratados con nitrofurantoína, d E. coli y E. faecalis tratados con vancomicina . e – h Repeticiones biológicas de 5a-5d, respectivamente. En todos los gráficos del perfil AST, S y R representan Susceptibilidad y Resistencia, respectivamente. Se muestran tasas de crecimiento normalizadas ± SEM en función del tiempo para cada especie detectada en los experimentos.

En conclusión, hemos demostrado que es posible producir AST rápido para muestras de especies mixtas mediante la realización de pruebas secuenciales de susceptibilidad fenotípica unicelular y la hibridación fluorescente in situ en un chip de microfluidos. Es importante destacar que la determinación de ID también es útil para muestras no mezcladas cuando es esencial saber qué puntos de corte MIC usar para realizar la llamada SIR (susceptible-intermedio-resistente). Aunque MALDI-TOF puede determinar especies para muestras no mezcladas, requiere muchas más células bacterianas que las imágenes directas de una sola célula.

Dado que los puntos de corte de susceptibilidad a los antibióticos de especies estrechamente relacionadas suelen ser los mismos, a veces puede ser suficiente distinguir la familia o los géneros bacterianos. Por ejemplo, un código de identificación de color específico para enterobacterias que cubra Escherichia, Klebsiella y Salmonella, que tienen puntos de corte de resistencia muy similares34. En este caso, diferentes sondas específicas de especies asignarían el mismo código de identificación de color, de modo que los diez códigos se puedan utilizar de manera más eficiente. De manera similar, esperamos que sea posible tener un código de identificación común para las especies contaminantes, de modo que no se confundan con patógenos. Sin embargo, si se requieren más de 10 códigos de identificación específicos, la extracción y reprobado permiten un aumento exponencial en la cantidad de clases que se pueden identificar35,36, pero a expensas de tiempo.

En la implementación actual, realizamos la prueba una concentración a la vez en un microscopio de investigación de alta gama y posprocesamos los datos de las imágenes. Para que la tecnología sea útil en un entorno clínico, los datos deben analizarse durante el experimento y el chip fluídico debe paralelizarse para ejecutar múltiples concentraciones de antibióticos simultáneamente. Aunque no hemos probado este tipo de configuración en el presente estudio, debería permitir una determinación de MIC para identificar aislados intermedios. Se ha desarrollado un sistema con cinco antibióticos diferentes en cinco concentraciones diferentes y un alto nivel de automatización para infecciones del tracto urinario no complicadas20, lo que demuestra que es posible ampliarlo a múltiples condiciones de prueba. Finalmente, nos gustaría enfatizar que el presente estudio es una prueba del principio de combinación de AST fenotípico y identificación de especies a nivel unicelular. Para que este método sea clínicamente relevante, es necesario calibrarlo y probarlo en muchos más aislados clínicos, así como en muestras de pacientes reales.

En este estudio, como representante gramnegativo utilizamos E. coli K12 MG1655 (DA4201), K. pneumoniae (ATCC 13883), A. baumanni (DA68153), P. mirabilis (ATCC 29906) y P. aeruginosa (DA6215). . Como representante grampositivo, utilizamos E. faecalis (ATCC 51299) y S. aureus (ATCC 29213). También utilizamos células de P. aeruginosa (PAO1-GFP) marcadas con fluorescencia, un amable regalo de Oana Ciofu37. Los antibióticos (ciprofloxacina, gentamicina, nitrofurantoína y vancomicina) se adquirieron en Sigma-Aldrich. Las soluciones madre se prepararon según las pautas del proveedor y se almacenaron a -20 °C. Las soluciones se descongelaron a temperatura ambiente antes de realizar los experimentos de AST. Utilizamos concentraciones de antibióticos correspondientes a los valores de CIM para E. coli (ATCC 25922) según lo definido por el Comité Europeo sobre Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST). Observamos que otra concentración más alta puede ser óptima para realizar una llamada SIR rápida.

En todos los experimentos, se utilizó como caldo medio Mueller-Hinton (MH) (70192; Sigma-Aldrich). Se prepararon cultivos nocturnos (ONC) inoculando bacterias a partir de reservas de glicerol (-80 °C) en medio MH e incubando a 37 °C durante 14 a 15 h con agitación continua (200 rpm). De ONC, las células se diluyeron 1:1000 veces en medio MH fresco suplementado con un tensioactivo (Pluronic F-108; 542342; Sigma-Aldrich; concentración final del 0,085 % (peso/vol)). El cultivo líquido se cultivó agitando a 200 rpm a 37 °C durante 2 h. A continuación, para realizar experimentos de AST, mezclamos las diferentes cepas en concentraciones iguales y las cargamos en el chip de microfluidos.

El chip consta principalmente de dos partes: un elastómero de silicona micromoldeado [Sylgard 184; polidimetilsiloxano (PDMS)] y un cubreobjetos de vidrio 1,5 (Menzel-Gläser) que están unidos covalentemente entre sí. El diseño y la preparación del chip se describieron previamente en 15,38. Estas referencias también describen la numeración de los puertos utilizados a continuación. Después de perforar los puertos en el chip, se colocó en el microscopio y se conectó el tubo (TYGON) con un conector de tubo metálico. Brevemente, las células se cargaron usando el puerto 8.0 y el puerto 2.0 se usó para el intercambio de medio con las sondas. Los puertos 5.1, 5.2 y 6.0 se usaron para el mantenimiento de la presión del canal posterior, y los puertos 2.1 y 2.2 se usaron para el suministro de medio MH con y sin antibióticos a una presión de 200 mbar. La presión fue controlada por un regulador OB1-Mk3 (Elveflow).

La obtención de imágenes comienza cinco minutos después del suministro de medio con y sin antibióticos a las células. Utilizamos un microscopio invertido Nikon Ti2-E equipado con un objetivo de inmersión en aceite Plan Apo Lambda 100 × (Nikon). Las imágenes fueron capturadas por la cámara Imaging Source (DMK 38UX304). Para imágenes de contraste de fase y fluorescencia, utilizamos la configuración óptica como se describió anteriormente en 15,38 y controlada por Micro-Manager39, y un complemento interno. Mantuvimos 30 °C utilizando una unidad de temperatura controlable y un recinto lexan (Oklab).

Las células se cargaron en el chip y se expusieron a medios de crecimiento con y sin antibióticos en dos filas diferentes. En cada fila, se tomaron imágenes de un total de 70 a 80 posiciones, cada una de las cuales incluía de 16 a 21 trampas celulares, en el canal de contraste de fase (tiempo de exposición de 30 ms) cada dos minutos durante una hora.

Después del fenotipado, el medio de los puertos 2.1 y 2.2 se despresurizó a cero. Para fijar las células, se añadió formaldehído (4%) cambiando el medio y aplicando una presión de 200 mbar desde el puerto 2,0 durante 4 minutos y posteriormente lavando las células con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 3 minutos. Las células se permeabilizaron con EtOH al 70% durante 4 min y se lavaron con 1 x PBS (3 min). Luego, las células se trataron con lisozima (2 mg/ml) y lisostafina (0,1 mg/ml) durante 3 minutos y luego se lavaron rápidamente con 1 x PBS durante otros 3 minutos. (La lisostafina sólo es necesaria para S. aureus y no se utilizó en la Fig. 3). Para la identificación de especies, agrupamos todas las sondas de ADNss específicas (0,1 μM) (Datos complementarios 1) en una solución de hibridación (formamida al 30% y 2 × SSC) y las hibridamos durante 30 minutos a 30 °C. En el caso del método combinatorio, agrupamos todas las sondas de detección (0,1 μM) (Datos complementarios 2) y secuencias adaptadoras específicas de especie (Datos complementarios 3) en una solución de hibridación (30% de formamida y 2 × SSC) y las hibridamos. durante 60 min a 30°C. A continuación, capturamos las imágenes de fluorescencia para cada sonda en diferentes canales (TYE 665, TYE 563, Texas Red y Alexa Fluor 488) con tiempos de exposición de 300 ms y las respectivas imágenes de contraste de fase con un tiempo de exposición de 30 ms. En total, se necesitaron entre 10 y 15 minutos para obtener imágenes de todas las posiciones en todos los canales del chip.

Las imágenes de contraste de fase de las células que crecen en canales se segmentaron tanto para células como para canales utilizando un modelo de aprendizaje profundo con el método Omnipose. El modelo de segmentación celular se entrenó con datos obtenidos de imágenes etiquetadas manualmente de datos de especies mixtas y datos obtenidos de E. coli (K12 MG1655 intC::P70-venusFast) que expresa constitutivamente mVenus. El procedimiento de capacitación se mejoró con aumentos de datos para forzar los resultados de aprendizaje de la red Omnipose en diferentes orientaciones y escalas. El entrenamiento y el rendimiento del modelo en comparación con U-net se describen en el método SI 1. El rendimiento de la red de segmentación en diferentes especies también se muestra en el método SI 1. El modelo de segmentación de canales se entrenó con datos que se refinaron en función de los perfiles de histograma, también descritos. en el método SI 2. Después de obtener las ubicaciones de los canales, se agruparon pilas de series temporales de células segmentadas y las correspondientes imágenes de canales fluorescentes para el seguimiento, la asignación de especies y los cálculos de la tasa de crecimiento.

Las células fueron rastreadas a lo largo del tiempo utilizando una red neuronal que puntúa los vínculos entre las células de un cuadro al siguiente y predice el tipo de vínculo entre ellas. Los datos de entrenamiento para el seguimiento de células se obtuvieron simulando el crecimiento de las células en los canales de la máquina madre y se describen en el método SI 4. Se utilizaron células de diferentes formas, tamaños y tasas de crecimiento para generar datos reales para la red de seguimiento. El entrenamiento de la red de seguimiento y su rendimiento se describen en el método SI 4. Las predicciones de la red se limpian en busca de errores utilizando la métrica IoU (Intersección sobre Unión) para eliminar predicciones falsas. En el momento de la prueba, las celdas entre fotogramas se vincularon según las puntuaciones de probabilidad y las pistas se generaron encadenando una serie de vínculos. Las pistas celulares se corrigieron para detectar errores (método SI 4).

Para los experimentos en los que una sola sonda se une a una sola especie, las imágenes fluorescentes para cada canal de la máquina madre se corrigieron para el fondo y las regiones continuas de señal por encima de los umbrales se asignaron a etiquetas de especies (método SI 3). Los experimentos con múltiples sondas fluorescentes para una sola especie se clasificaron utilizando un clasificador de bosque aleatorio, descrito en el método SI 6. Se identificaron regiones continuas correspondientes a una especie (>90 píxeles) y se dibujaron cuadros delimitadores alrededor de estas regiones. Las pistas de células que caían en estas regiones en el último cuadro antes de fijar las células se etiquetaron con las especies correspondientes y todas las etiquetas de especies se retrocedieron al punto de tiempo 0. Las tasas de crecimiento se calcularon ajustando curvas exponenciales en las áreas de las células en un punto de tiempo en movimiento 5. ventana (método SI 7).

Las secuencias de sonda FISH para el ARNr objetivo individual se obtuvieron de probeBase21,40,41 y se compraron en Integrated DNA Technologies (www.idt.com), consulte los datos complementarios 1. Para el sondeo FISH combinatorio, utilizamos secuencias de códigos de barras y sondas de detección. que se enumeran en los Datos complementarios 2 a 4, adquiridos en IDT.

Todos los experimentos se realizaron utilizando la misma configuración. Tanto las células tratadas como las de referencia utilizaron los mismos modelos de segmentación y seguimiento. Los experimentos no fueron aleatorios. Para las mediciones de la tasa de crecimiento, la tasa de crecimiento de cada especie se calculó utilizando al menos 100 células. Las células con errores de segmentación no se incluyeron en los cálculos de la tasa de crecimiento. Todos los perfiles AST muestran tasas de crecimiento normalizadas ± SEM. Puede encontrar información detallada sobre las repeticiones experimentales en la leyenda de la figura individual.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos de microscopía sin procesar de todos los experimentos que se muestran en el artículo están disponibles en https://doi.org/10.17044/scilifelab.20969161. Todos los objetos de análisis y el código también están disponibles en https://doi.org/10.17044/scilifelab.20969161. Todas las cepas se proporcionarán previa solicitud a JE. Los datos fuente se proporcionan con este documento.

El código utilizado para analizar y reproducir todas las figuras está disponible en https://github.com/karempudi/ASTFISH.git. Los pesos de las redes neuronales entrenadas para la segmentación y el seguimiento de células están disponibles en https://doi.org/10.17044/scilifelab.20969161.

GBD 2016 Causes of Death Collaborators Mortalidad global, regional y nacional específica por edad y sexo para 264 causas de muerte, 1980-2016: un análisis sistemático para el estudio de carga global de enfermedades 2016. Lancet 390, 1151-1210 (2017).

Artículo de Google Scholar

O'Neill. Resistencia a los antimicrobianos: afrontar una crisis para la salud y la riqueza de las naciones. Revisión sobre la resistencia a los antimicrobianos. https://amr-review.org/ (2014).

O'Neil, J. Abordar las infecciones resistentes a los medicamentos a nivel mundial: informe final y recomendaciones. https://books.google.com/books/about/Tackling_Drug_Resistente_Infections_Globa.htmlhl=&id=aa6lAQAACAAJ (2016).

van Belkum, A. et al. Sistemas de pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos innovadores y rápidos. Nat. Rev. Microbiol. 18, 299–311 (2020).

Artículo de Google Scholar

Schoepp, NG et al. Pruebas rápidas de susceptibilidad a antibióticos fenotípicos específicos de patógenos mediante cuantificación LAMP digital en muestras clínicas. Ciencia. Traducción Medicina. 9, eaal3693 (2017).

Bernhard, M., Lichtenstern, C., Eckmann, C. y Weigand, MA La terapia antibiótica temprana en pacientes sépticos: ¿hito o punto de conflicto? Crítico. Cuidado 18, 671 (2014).

Artículo de Google Scholar

Kumar, A. y col. La duración de la hipotensión antes del inicio de una terapia antimicrobiana eficaz es el determinante crítico de la supervivencia en el shock séptico humano. Crítico. Cuidado médico. 34, 1589-1596 (2006).

Artículo de Google Scholar

Ibrahim, EH, Sherman, G., Ward, S., Fraser, VJ y Kollef, MH La influencia del tratamiento antimicrobiano inadecuado de las infecciones del torrente sanguíneo en los resultados de los pacientes en la UCI. Cofre 118, 146-155 (2000).

Artículo CAS Google Scholar

Caliendo, AM et al. Mejores pruebas, mejor atención: mejores diagnósticos de enfermedades infecciosas. Clínico. Infectar. Dis. 57, S139-S170 (2013).

Artículo de Google Scholar

Kumar, A. y col. El inicio de una terapia antimicrobiana inadecuada produce una reducción cinco veces mayor de la supervivencia en el shock séptico humano. Cofre 136, 1237-1248 (2009).

Artículo de Google Scholar

Ventola, CL La crisis de resistencia a los antibióticos: parte 1: Causas y amenazas. PT 40, 277–283 (2015).

PubMed PubMed Central Google Académico

Vasala, A., Hytönen, VP & Laitinen, OH Herramientas modernas para el diagnóstico rápido de la resistencia a los antimicrobianos. Frente. Celúla. Infectar. Microbiol. 10, 308 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Cockerill, FR Métodos genéticos para evaluar la resistencia a los antimicrobianos. Quimioterapia de agentes antimicrobianos. 43, 199–212 (1999).

Artículo CAS Google Scholar

Bard, JD y Lee, F. ¿Por qué no podemos simplemente usar PCR? El papel de las pruebas genotípicas versus fenotípicas para las pruebas de resistencia a los antimicrobianos. Clínico. Microbiol. Noticiasl. 40, 87–95 (2018).

Artículo de Google Scholar

Baltekin, Ö., Boucharin, A., Tano, E., Andersson, DI y Elf, J. Pruebas de susceptibilidad a los antibióticos en menos de 30 minutos mediante imágenes unicelulares directas. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 114, 201708558 (2017).

Kaushik, AM y cols. Las mediciones unicelulares basadas en gotas de ARNr 16S permiten la identificación integrada de bacterias y pruebas de susceptibilidad antimicrobiana fenomolecular a partir de muestras clínicas en 30 minutos. Adv. Ciencia. 8, 2003419 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Rychert, J. Beneficios y limitaciones de la espectrometría de masas MALDI-TOF para la identificación de microorganismos. J. Infectiología 2, 1–5 (2019).

Artículo de Google Scholar

Ferreira, L. et al. Identificación directa de patógenos del tracto urinario a partir de muestras de orina mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización y desorción asistida por matriz. J.Clin. Microbiol. 48, 2110-2115 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

de Roux, A. et al. Neumonía mixta adquirida en la comunidad en pacientes hospitalizados. EUR. Respirar. J. 27, 795–800 (2006).

Artículo de Google Scholar

Baltekin, O. et al. Evaluación de un método de prueba ultrarrápido de susceptibilidad a antibióticos en hemocultivos positivos con Escherichia coli. Preimpresión en medRxiv https://doi.org/10.1101/2021.12.14.21267046 (2021).

Kempf, VAJ, Trebesius, K. & Autenrieth, IB La hibridación fluorescente in situ permite una rápida identificación de microorganismos en hemocultivos. J.Clin. Microbiol. 38, 830–838 (2000).

Artículo CAS Google Scholar

O'Connor, OM, Alnahhas, RN, Lugagne, J.-B. & Dunlop, MJ DeLTA 2.0: Un proceso de aprendizaje profundo para cuantificar la dinámica espacial y temporal unicelular. Computación PLoS. Biol. 18, e1009797 (2022).

Artículo de Google Scholar

Ronneberger, O., Fischer, P. & Brox, T. U-Net: Redes convolucionales para la segmentación de imágenes biomédicas. Computación de notas de clase. Ciencia. https://doi.org/10.1007/978-3-319-24574-4_28 (2015).

Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M. y Pachitariu, M. Cellpose: un algoritmo generalista para la segmentación celular. Nat. Métodos 18, 100–106 (2020).

Artículo de Google Scholar

Cutler, KJ y cols. Omnipose: una solución independiente de la morfología de alta precisión para la segmentación de células bacterianas. Métodos Nat https://doi.org/10.1038/s41592-022-01639-4 (2022).

Waisman, A., Norris, AM, Elías Costa, M. & Kopinke, D. Segmentación y cuantificación automática e imparcial de miofibras en el músculo esquelético. Ciencia. Rep. 11, 1-14 (2021).

Artículo de Google Scholar

Magnusson, KEG, Jalden, J., Gilbert, PM y Blau, HM Vinculación global de pistas celulares utilizando el algoritmo de Viterbi. Traducción IEEE. Medicina. Imágenes 34, 911–929 (2015).

Artículo de Google Scholar

Bertinetto, L., Valmadre, J., Henriques, JF, Vedaldi, A. & Torr, PHS Redes siamesas totalmente convolucionales para seguimiento de objetos. En Visión por Computadora - Talleres ECCV 2016 850–865 (2016).

Weng, X., Wang, Y., Man, Y. & Kitani, KM GNN3DMOT: Red neuronal gráfica para seguimiento de múltiples objetos en 3D con aprendizaje de múltiples funciones 2D-3D. En 2020 Conferencia IEEE/CVF sobre visión por computadora y reconocimiento de patrones (CVPR) (2020).

Wang, J. y col. Nanosistemas magnéticos identificables por especies bacterianas para el diagnóstico temprano de sepsis y la desinfección fotodinámica extracorpórea de la sangre. Nanoescala 10, 132-141 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Charnot-Katsikas, A. et al. Uso del sistema feno acelerado para la identificación y pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos de patógenos en hemocultivos positivos y su impacto en el tiempo de obtención de resultados y el flujo de trabajo. J.Clin. Microbiol. 56, e01166-17 (2017).

Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G. & Greub, G. Diagnóstico de bacteriemia basado en hemocultivos: estado de la técnica. Clínico. Microbiol. Infectar. 21, 313–322 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Tabah, A. y col. Características y determinantes del resultado de las infecciones del torrente sanguíneo adquiridas en hospitales en unidades de cuidados intensivos: el estudio de cohorte internacional EUROBACT. Medicina de Cuidados Intensivos. 38, 1930-1945 (2012).

Artículo de Google Scholar

EUCAST- Comité europeo sobre pruebas de sensibilidad a los antibióticos. Puntos de interrupción clínicos: puntos de interrupción y orientación https://www.eucast.org/clinical_breakpoints/ (2021).

Lubeck, E., Coskun, AF, Zhiyentayev, T., Ahmad, M. y Cai, L. Perfiles de ARN in situ unicelulares mediante hibridación secuencial. Nat. Métodos 11, 360–361 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Chen, KH, Boettiger, AN, Moffitt, JR, Wang, S. y Zhuang, X. Imágenes de ARN. Perfiles de ARN altamente multiplexados y resueltos espacialmente en células individuales. Ciencia 348, aaa6090 (2015).

Zaborskyte, G., Andersen, JB, Kragh, KN y Ciofu, O. Monitoreo en tiempo real de la aparición y dinámica de mutantes nfxB en biopelículas de Pseudomonas aeruginosa expuestas a concentraciones subinhibitorias de ciprofloxacina. Quimioterapia de agentes antimicrobianos. 61, e02292-16 (2017).

Camsund, D. y col. Detección CRISPRi basada en imágenes de resolución temporal. Nat. Métodos 17, 86–92 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Edelstein, AD y cols. Métodos avanzados de control del microscopio mediante el software μManager. J. Biol. Métodos 1, e10 (2014).

Artículo de Google Scholar

Alm, EW, Oerther, DB, Larsen, N., Stahl, DA y Raskin, L. La base de datos de sondas de oligonucleótidos. Aplica. Reinar. Microbiol. 62, 3557–3559 (1996).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Greuter, D., Loy, A., Horn, M. y Rattei, T. probeBase: un recurso en línea para cebadores y sondas de oligonucleótidos dirigidos a ARNr: nuevas características 2016. Nucleic Acids Res. 44, D586-D589 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

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Deseamos agradecer a I. Barkefors por su útil aporte al manuscrito y su ayuda con las figuras. Reconocemos la financiación de SSF (JE: ARC19-0016), el Consejo Europeo de Investigación (JE: BIGGER:885360), la Fundación Knut y Alice Wallenberg (JE: 2016.0077; 2017.0291; 2019.0439) y la iniciativa de ciencia electrónica eSSENCE. Los cálculos y el manejo de datos fueron posibles gracias a los recursos proporcionados por la Infraestructura Nacional Sueca de Computación (SNIC), parcialmente financiada por el Consejo Sueco de Investigación a través del acuerdo de subvención no. 2018-05973.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Uppsala.

Estos autores contribuyeron igualmente: Vinodh Kandavalli, Praneeth Karempudi.

Departamento de Biología Celular y Molecular, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia

Vinodh Kandavalli, Praneeth Karempudi, Jimmy Larsson y Johan Elf

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JE concibió la identificación in situ después del método AST, y PK desarrolló e implementó los métodos de análisis y analizó los datos. VK y JL realizaron los experimentos y desarrollaron el protocolo para el sondeo FISH en el chip fluídico. JE, PK y VK escribieron el artículo.

Correspondencia a Johan Elf.

JE patentó el método (US 10.041.104) y fundó la empresa Astrego Diagnostics. Todos los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a Péter Horváth y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

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Kandavalli, V., Karempudi, P., Larsson, J. et al. Pruebas rápidas de susceptibilidad a antibióticos e identificación de especies para muestras mixtas. Nat Comuna 13, 6215 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33659-1

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Recibido: 10 de septiembre de 2021

Aceptado: 28 de septiembre de 2022

Publicado: 20 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33659-1

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