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Jun 22, 2024

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Nature Biomedical Engineering (2023)Cite este artículo 8956 Accesos 3 Citas 173 Detalles de Altmetric Metrics Durante la cirugía, el diagnóstico histopatológico rápido y preciso es esencial para la evaluación clínica.

Ingeniería Biomédica de la Naturaleza (2023)Citar este artículo

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Durante la cirugía, el diagnóstico histopatológico rápido y preciso es esencial para la toma de decisiones clínicas. Sin embargo, el método predominante de consulta de patología intraoperatoria requiere mucho tiempo, mano de obra y costos, y requiere la experiencia de patólogos capacitados. Aquí mostramos que las muestras de biopsia se pueden analizar en 30 minutos mediante la evaluación secuencial de los fenotipos físicos de células suspendidas singularizadas disociadas de los tejidos. El método de diagnóstico combina la disociación mecánica de tejidos sin enzimas, citometría de deformabilidad en tiempo real a velocidades de 100 a 1000 células s-1 y análisis de datos mediante reducción de dimensionalidad no supervisada y regresión logística. Los parámetros de fenotipo físico extraídos de imágenes de campo claro de células individuales distinguieron subpoblaciones celulares en varios tejidos, mejorando o incluso sustituyendo las mediciones de marcadores moleculares. Utilizamos el método para cuantificar el grado de inflamación del colon y discriminar con precisión tejido sano y tumoral en muestras de biopsia de colon humano y de ratón. Este enfoque rápido y sin etiquetas puede ayudar a la detección intraoperatoria de cambios patológicos en biopsias sólidas.

Los cambios en las propiedades físicas de las células, como el tamaño, la forma o la deformabilidad de las células, son fundamentales para la patología de algunas enfermedades y tienen un gran potencial como marcador de diagnóstico o pronóstico1,2. En las últimas décadas, se han desarrollado una variedad de herramientas para examinar las propiedades mecánicas de las células, incluida la aspiración con micropipetas, la microscopía de fuerza atómica, la reometría de microperlas y las trampas ópticas3,4. En este campo se ha observado un aumento exponencial de publicaciones que sugieren una fuerte correlación entre el fenotipo mecánico celular y el estado de la enfermedad, incluida la sepsis5,6, la malaria7, la diabetes8, la anemia falciforme9 y el cáncer10,11,12. Desafortunadamente, estas técnicas convencionales adolecen de un bajo rendimiento celular y de la necesidad de un profundo conocimiento especializado para su funcionamiento, lo que limita su uso como herramienta de diagnóstico. La citometría de fluorescencia y deformabilidad en tiempo real (RT-FDC)13,14 es una de varias técnicas microfluídicas nuevas10,15,16,17,18,19,20,21,22 que han superado estos inconvenientes, permitiendo la evaluación de propiedades físicas. de células individuales sin etiquetas y de alto rendimiento, abriendo una nueva vía al diagnóstico clínico. RT-FDC no solo es rápido (con hasta 1000 células analizadas por segundo), sino que además de la deformabilidad de las células, también proporciona información multidimensional obtenida directamente de imágenes de células. El potencial diagnóstico de RT-FDC se ha demostrado en muchas enfermedades humanas que van desde leucemia hasta infecciones bacterianas y virales, incluida la enfermedad por coronavirus 2019 (refs.23,24,25,26,27). Sin embargo, hasta ahora, la aplicabilidad de la técnica se limitaba al análisis de células cultivadas o biopsias líquidas de sangre o médula ósea.

La biopsia de tejido sólido es el método más común para caracterizar la malignidad y es fundamental para guiar a los cirujanos durante el manejo intraoperatorio y perioperatorio de los pacientes con cáncer. La evaluación diagnóstica de biopsias de tejido sólido comúnmente se realiza a través de una consulta de patología intraoperatoria, que se basa en el análisis histopatológico de secciones de biopsia congeladas28. El flujo de trabajo convencional del diagnóstico intraoperatorio implica numerosos pasos de procesamiento, reactivos de tinción y la inspección microscópica de cortes de tejido por parte de patólogos experimentados para un análisis experto. Además, la preparación de muestras requiere mucho tiempo, recursos y mano de obra. Se han propuesto flujos de trabajo alternativos28, incluida la espectroscopia Raman estimulada29,30, la tomografía de coherencia óptica31 y la microscopía de fluorescencia32,33, pero aún no se han implementado. Por tanto, la necesidad de un enfoque que reduzca la preparación de muestras y el tiempo hasta el diagnóstico es inminente.

En este artículo, presentamos un método de diagnóstico rápido y sin etiquetas para biopsias de tejido sólido. El enfoque combina la disociación mecánica de tejidos sin enzimas utilizando un triturador de tejidos (TG) para el aislamiento rápido y sencillo de células individuales viables34,35 con la evaluación secuencial de fenotipos físicos celulares de miles de células individuales utilizando RT-FDC. Primero, analizamos un panel de diferentes tejidos de ratón y evaluamos el rendimiento celular, la viabilidad y la viabilidad de la medición RT-FDC tras la disociación mecánica del tejido. Ilustramos la capacidad de distinguir subpoblaciones de células de tejido basándose únicamente en los parámetros físicos derivados de imágenes sin conocimiento previo ni etiquetado molecular adicional, lo que puede mejorar la citometría de flujo convencional, que se basa en paneles de marcadores multicolores para identificar células. También mostramos que nuestro enfoque puede determinar cambios inflamatorios en el tejido del colon, basándose en la medición de la deformabilidad celular en el sistema de microfluidos. Además, examinamos muestras de biopsia frescas y congeladas de colon humano y de ratón y mostramos que RT-FDC puede distinguir tejidos sanos de cancerosos mediante el uso de análisis de componentes principales (PCA) y aprendizaje automático en datos multidimensionales. Los hallazgos demuestran que la evaluación del fenotipo físico de células individuales derivadas de tejido mediante RT-FDC es una estrategia alternativa para detectar un estado inflamatorio o maligno. Nuestro procedimiento, que puede ofrecer resultados en 30 minutos, tiene potencial como método de diagnóstico intraoperatorio para detectar con sensibilidad cambios patológicos en biopsias y, de manera más general, para identificar y caracterizar poblaciones de células en tejidos de una manera imparcial y sin marcadores.

Antes de evaluar el fenotipo físico de las células, el primer desafío al que se enfrentó fue la extracción rápida de células individuales de tejidos sólidos en una escala de tiempo de minutos, mientras se buscaba una representación lo más precisa posible de la heterogeneidad de las subpoblaciones celulares. Para ello, utilizamos un TG, un dispositivo de disociación mecánica basado en filas contrarrotativas de dientes rechinantes (Fig. 1) ensamblados en un tubo Falcon35. El dispositivo ejecuta automáticamente una secuencia predefinida de pasos alternos de corte y trituración para aislar células individuales de un tejido sólido. En total, se procesaron diez tejidos murinos diferentes utilizando TG o protocolos enzimáticos convencionales para comparar (Tablas complementarias 1 y 2). La viabilidad fue del 70 al 90% en la mayoría de los tejidos; El rendimiento celular fue similar a la disociación enzimática y dependiente del tejido (Datos ampliados, Fig. 1). La ventaja clave de la disociación mecánica fue que el tiempo de procesamiento tomó menos de 5 minutos por muestra, a diferencia de decenas de minutos o incluso varias horas para los protocolos enzimáticos. La velocidad de la extracción presumiblemente ayuda a preservar los fenotipos bioquímicos y biofísicos en condiciones cercanas a las in situ.

La muestra de tejido se disecciona en trozos pequeños y se coloca en el rotor interno de la unidad TG que contiene medio de cultivo35. La disociación mecánica se realiza mediante una secuencia preprogramada y ejecutada automáticamente de rotaciones en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj. Las células disociadas se centrifugan y se resuspenden en tampón de medición. La muestra se carga en un chip de microfluidos y se analiza mediante RT-FDC. Se captura una imagen de campo claro de cada una de las aproximadamente 10.000 células. De las imágenes se extraen varias características, que se utilizan para el análisis multidimensional. En total, el procedimiento desde el tejido hasta el resultado dura menos de 30 minutos.

A continuación, las células individuales extraídas se analizaron utilizando RT-FDC. En una medición RT-FDC, cientos de células por segundo, suspendidas en un tampón de metilcelulosa de alta viscosidad, se empujan a través de una constricción de un canal de microfluidos, donde se deforman por la tensión de corte y los gradientes de presión y se obtiene una imagen de cada célula. Se calcularon varios parámetros físicos a partir de las imágenes en tiempo real, a saber, deformación, tamaño de celda, brillo, desviación estándar del brillo, relación de aspecto y relación de área (para más detalles, consulte la Tabla complementaria 3). Además, se utilizó el módulo de fluorescencia14 para detectar la expresión de marcadores de superficie celular.

En la Fig. 2 se muestran ejemplos ilustrativos de la distribución de parámetros físicos de células extraídas de hígado, colon y riñón. Cada uno de estos grupos estaba compuesto por células con fenotipo físico similar (según el gráfico de densidad) y expresión de marcador de superficie (extendida). Datos Fig. 2). Por ejemplo, un grupo de células con propiedades físicas similares (en este caso definidas por el brillo promedio y el tamaño celular) estaba compuesto principalmente por células positivas para la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) (Fig. 2a), lo que demuestra que una población limpia de células epiteliales Las celdas se pueden distinguir sin etiquetas, utilizando únicamente parámetros físicos derivados de imágenes.

a, Diagrama de dispersión ilustrativo del brillo promedio versus el tamaño celular para células aisladas del hígado que muestra numerosos grupos de células. La población marcada de células (que forma un grupo de células con un tamaño de 25 a 50 μm2 y un brillo promedio de 100 a 115) está enriquecida con células (epiteliales) positivas para EpCAM, pero carece de células (endoteliales) positivas para CD31 o células positivas para CD45 (leucocitos). ). FITC, isotiocianato de fluoresceína; PE, ficoeritrina; APC, aloficocianina. b, Gráficos de dispersión ilustrativos de células de colon teñidas para marcadores de superficie celular EpCAM y CD45. Dentro de la población positiva para EpCAM, se pueden identificar siete subpoblaciones de células basándose en gráficos de densidad de parámetros físicos, como el brillo y el tamaño de las células. c, Diagramas de dispersión ilustrativos de células renales teñidas para EpCAM y CD45. Dentro de la población CD45, se identifican cuatro subpoblaciones en función de las similitudes en el tamaño y la deformación de las células. El mapa de colores en los diagramas de dispersión representa la densidad del evento.

La Figura 2b,c ilustra la ventaja de usar fenotipado físico basado en imágenes además de usar solo citometría de flujo convencional basada en fluorescencia. En la citometría de flujo convencional es casi imposible distinguir subpoblaciones individuales de células epiteliales (EpCAM+) a menos que se utilicen paneles adicionales de anticuerpos fluorescentes contra tipos de células conocidos y predefinidos. La distinción de varias subpoblaciones fue posible con RT-FDC debido a la profundidad de información adicional proporcionada por los parámetros del fenotipo físico. Dentro de las células epiteliales del colon, identificamos siete grupos de células basándose únicamente en el brillo y el tamaño (Fig. 2b). De manera similar, dentro de la población de leucocitos (CD45+) del riñón, encontramos cuatro grupos diferentes según el tamaño de las células y los parámetros de deformación (Fig. 2c). Observamos que, utilizando la modalidad de clasificación desarrollada recientemente para RT-FDC36, cualquiera de estas poblaciones de células puede aislarse de acuerdo con los parámetros derivados de la imagen y analizarse para determinar su identidad molecular, por ejemplo, mediante secuenciación de ARN posterior.

RT-FDC también se puede utilizar para capturar interacciones celulares. Utilizando los parámetros de relación de aspecto y tamaño celular, identificamos dobletes celulares en muestras de timo, bazo y riñón. Muchos dobletes estaban compuestos por dos tipos de células diferentes, según los marcadores de la superficie celular (Datos ampliados, figura 3). La posición de la célula dentro del canal en combinación con la posición del pico de fluorescencia nos permitió identificar, por ejemplo, que un doblete estaba compuesto por un leucocito (CD45+) y una célula endotelial (CD31+) (Datos ampliados, Fig. 3b, d,f). Utilizando el módulo de clasificación RT-FDC36, los dobletes celulares se pueden aislar sin etiquetas para análisis moleculares adicionales y aplicaciones posteriores, incluidos estudios de células inmunes que interactúan físicamente en el tejido37.

Una cuestión importante a considerar cuando se utiliza la disociación mecánica de tejidos y el análisis sin etiquetas por fenotipo físico es si este enfoque representa fielmente la distribución de los tipos de células presentes en el tejido. Si bien esto es imposible de evaluar para todos los tejidos y aplicaciones en general, es instructivo observar más de cerca el hígado como un tejido específico (Datos ampliados, figuras 4a a c). La disociación mecánica parece menos perjudicial para las células sensibles como los hepatocitos, que son propensos a la muerte celular y a menudo se pierden durante los procedimientos de aislamiento estándar38. Tras la disociación del tejido hepático murino, las células con un área celular de sección transversal superior a 150 μm2 (radio de ~7 μm) se determinaron como hepatocitos según su morfología y tamaño39. Como principal tipo de células parenquimatosas del hígado, los hepatocitos representan el 70% de la población de células hepáticas y ocupan casi el 80% del volumen del hígado40. En la suspensión celular obtenida usando TG, la proporción de hepatocitos con respecto al total de células fue en promedio del 52,5%, mucho más cercana a la representación real en el tejido en comparación con el 7,7% de la digestión enzimática. Además, se pudieron identificar distintas subpoblaciones de hepatocitos según el tamaño de las células. Nuestra hipótesis es que estas poblaciones corresponden a hepatocitos de diferente ploidía, ya que el contenido de ADN está fuertemente correlacionado con el volumen celular41. Si se confirma, por ejemplo, mediante correlación con un análisis cuantitativo de fluorescencia de la cantidad de ADN en cada célula, nuestro método podría servir como herramienta para el seguimiento sin etiquetas del envejecimiento y los procesos fisiopatológicos en el hígado, que están relacionados con la proporción de poliploides. hepatocitos42. En otros tejidos, como el pulmón, las diferencias entre la disociación mecánica y enzimática no fueron tan prominentes y ninguna de las técnicas dio un sesgo hacia una población celular específica (Datos ampliados, figura 4d). Sin embargo, para la aplicabilidad general de nuestro enfoque a las diversas posibilidades que abre para el análisis de tejidos, por supuesto, se necesita más trabajo experimental.

Hay aplicaciones específicas, en particular de diagnóstico, de nuestro enfoque en las que la determinación fiel del número de células originalmente presentes en el tejido in situ es menos importante. Después de todo, los fenotipos físicos detectados también reflejan diversas respuestas celulares al procesamiento de la muestra, la adhesión de las células entre sí y a la matriz extracelular, y la conectividad y resistencia mecánica dentro del tejido. Todos estos aspectos pueden alterarse en condiciones patológicas y serían recogidos por nuestro enfoque. Demostramos la utilidad diagnóstica en dos casos de uso específicos clínicamente relevantes relacionados con el colon.

Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, son trastornos inflamatorios crónicos del intestino asociados con una barrera epitelial/mucosa comprometida y activación/reclutamiento de células inmunitarias43. Aunque la etiología de la EII aún no se comprende completamente, gran parte de nuestro conocimiento sobre la EII proviene de modelos animales experimentales de inflamación intestinal. Uno de esos modelos es la transferencia adoptiva de células T vírgenes a ratones con deficiencia de Rag1 para inducir colitis experimental (modelo de colitis crónica de transferencia de células T, en adelante denominado colitis por transferencia). Luego, la gravedad se cuantifica comúnmente mediante una puntuación histopatológica generada a partir de portaobjetos del tejido del colon teñidos con hematoxilina y eosina (H&E).

Nuestro objetivo era investigar los cambios en el fenotipo físico de las células del colon durante la colitis por transferencia. Los diagramas de dispersión de deformación versus tamaño celular sugieren una diferencia entre el tejido enfermo y el tejido sano (Fig. 3a), donde las células del tejido enfermo parecen menos deformadas que las células del tejido sano. Tras el examen de las células CD45+ (Fig. 3b,c), se hizo evidente que las muestras de colitis por transferencia se caracterizaban por una gran abundancia de leucocitos con baja deformación, probablemente linfocitos. En general, encontramos una disminución significativa de la deformación mediana con un fuerte tamaño del efecto en las muestras de colitis por transferencia, acompañada de un aumento significativo en el porcentaje de leucocitos, de acuerdo con la infiltración de linfocitos transferidos adoptivamente (N = 14; Fig. 3d). La deformación mediana de las células se correlacionó fuertemente negativamente con el porcentaje de leucocitos, con un coeficiente de correlación de Pearson de r (12) = −0,69 (P = 0,0065; Fig. 3e). Además, los valores medianos del tamaño celular y la deformación se vincularon con la puntuación de H&E de expertos (Figura complementaria 1); aunque la correlación mediante ajuste lineal no fue posible. Las muestras de colitis por transferencia con una puntuación H&E alta mostraron un tamaño celular más grande y una deformación menor en comparación con el tejido sano. Una observación digna de mención fue que era más difícil dividir mecánicamente el tejido sano en células individuales que el tejido enfermo, lo que produjo más eventos para el análisis.

a, Gráficos de dispersión de tamaño celular versus deformación de células aisladas de muestras de tejido de colitis por transferencia (TC) en comparación con tejido de colon murino sano (Control); con el tamaño de celda correspondiente y los histogramas de deformación. b, Las mismas dos muestras de colon seleccionadas para células CD45 positivas, que muestran el enriquecimiento de leucocitos en muestras de colitis por transferencia, acompañado de cambios en los parámetros del fenotipo físico. El mapa de colores en los diagramas de dispersión representa la densidad del evento. c, Gráficos de estimación de densidad de núcleo de las muestras que se muestran en a y b, con contornos que marcan los niveles 0,5 (sombra clara, contorno exterior) y 0,95 (sombra oscura, contorno interior). d, Cuantificación de la deformación media y porcentaje de células CD45 positivas (n = 14 animales biológicamente independientes en tres experimentos independientes). Los cuadros se extienden desde el percentil 25 al 75 con una línea en la mediana; los bigotes abarcan 1,5 veces el rango intercuartil. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney bilateral; deformación mediana *P = 0,0227 y r = 0,55, % CD45+ **P = 0,0041 y r = 0,7 (r, tamaño del efecto). e, correlación bilateral de Pearson entre la deformación media de todas las células y la proporción de leucocitos (células CD45+); P = 0,0065 y r = −0,69.

Nuestras observaciones de que el fenotipo físico de las células cambia con la inflamación, junto con la creciente evidencia de que la inflamación crónica está asociada con la malignidad44,45, nos llevaron a especular que nuestro enfoque podría detectar cambios en muestras de biopsia de tumores. Confirmamos esta posibilidad tanto para muestras humanas como de ratones.

Estudios anteriores han encontrado diferencias entre las propiedades mecánicas de las células cancerosas y sus contrapartes sanas11,12,46,47,48,49. Un inconveniente importante de estos estudios es la laboriosa preparación de las muestras y el bajo rendimiento de las mediciones, que limitan la conversión de estos estudios a enfoques de diagnóstico reales. Dada la rapidez de nuestro enfoque para obtener y analizar el fenotipo mecánico de células individuales de tejidos sólidos, exploramos su potencial para detectar el cáncer colorrectal. Utilizamos ratones deficientes en una proteína específica de las células epiteliales intestinales con un papel clave en la integridad epitelial. Estos animales desarrollan espontáneamente tumores de colon. Examinamos un total de 16 ratones y comparamos células aisladas de tumores con células de una parte sana del colon del mismo animal. Analizamos células de más de 60 µm2 (determinadas por el área de la sección transversal), ya que por debajo de este umbral la muestra estaba compuesta principalmente por células inmunes y pequeños desechos (Figura complementaria 2).

Nuestros resultados mostraron que el fenotipo físico de las células del tejido tumoral difería significativamente del de las muestras de control. Los gráficos representativos de un solo ratón en las figuras 4a a c demuestran que las células del tumor tenían un tamaño celular mayor y una mayor deformación que sus contrapartes sanas. El análisis de las 32 muestras reveló que las células de los tumores tenían un tamaño celular medio (Fig. 4d), deformación (Fig. 4e) y relación de área (Fig. 4g) significativamente mayores, con tamaños de efecto de moderados a fuertes. Las muestras de tumores también mostraron una mayor heterogeneidad, lo que se demuestra por la distribución más amplia en la Fig. 4c y desviaciones estándar significativamente más altas del tamaño celular y la proporción de área (Fig. 4d, g).

a,b, Gráficos de dispersión de tamaño celular versus deformación de una muestra de control (a) de tejido de colon murino en comparación con tejido tumoral (b). El mapa de colores en los diagramas de dispersión representa la densidad del evento. c, Gráficos de estimación de densidad de núcleo de las muestras que se muestran en a y b, con contornos que marcan los niveles 0,5 (sombra clara, contorno exterior) y 0,95 (sombra oscura, contorno interior). Los histogramas de tamaño y deformación de las células demuestran una mayor heterogeneidad del tamaño de las células y la deformación en el tumor (verde) en comparación con el tejido de control (púrpura). d – g, medias y desviaciones estándar de los parámetros del fenotipo físico de 16 muestras de control (púrpura) y 16 muestras de tumores (verde) (n = 16 animales biológicamente independientes en seis experimentos independientes). Los cuadros se extienden desde el percentil 25 al 75 con una línea en la mediana; los bigotes abarcan 1,5 veces el rango intercuartil. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba de rangos con signos de Wilcoxon bilateral; r, tamaño del efecto: tamaño de celda (**P = 0,0019, r = 0,55), desviación estándar del tamaño de celda (***P = 0,0005, r = 0,61) (d); deformación (*P = 0,026, r = 0,39), desviación estándar de la deformación (NS, no significativa) (e); relación de aspecto (NS), desviación estándar de la relación de aspecto (NS) (f); relación de área (**P = 0,0023, r = 0,54), desviación estándar de la relación de área (*P = 0,013, r = 0,44) (g). h, PCA de muestras de tejido de colon de ratón, donde los puntos verdes representan muestras de tumores y los puntos morados representan las muestras de control. Se realizó un análisis de regresión lineal en PC1 y PC2 y las dos categorías resultantes se muestran con colores de fondo violeta (control) y verde (tumor).

A continuación, investigamos si las diferencias de fenotipo físico podrían aprovecharse para distinguir de manera confiable entre tejido tumoral y sano. Para ello, dividimos las células en tres categorías según su tamaño (60–90, 80–120 y 120–400 μm2). Para cada categoría de tamaño, se derivaron 12 parámetros: media, mediana y desviaciones estándar del tamaño de celda, deformación, relación de aspecto y relación de área; sumando un total de 36 parámetros para cada muestra (Figura complementaria 3). Estos parámetros se utilizaron para PCA, Fig. 4h. Los dos componentes principales, PC1 (39,8%) y PC2 (18,7%), explicaron el 58,5% de la varianza. La importancia relativa de las características físicas para determinar los componentes principales se muestra en la figura complementaria 3. La característica más dominante para PC1 fue la deformación de las células entre 60 y 120 µm2, mientras que en el caso de PC2, prevalecieron los parámetros de tamaño de las células. La regresión logística realizada en el PCA (mostrada por la división lineal en la Fig. 4h) demostró que la información condensada del fenotipo físico representada por los componentes principales es suficiente para distinguir entre tejido sano y tumoral; 29 de 32 muestras se encontraban en la región correcta. Finalmente, analizamos la correlación entre la deformación y el tamaño de la celda y descubrimos que era débil o inexistente (Figura complementaria 4). Esto nos llevó a concluir que la deformación y el tamaño de las células eran predictores independientes de tumores en muestras de colon murino, lo que demuestra aún más el valor agregado de la deformación medida mediante RT-FDC como marcador de diagnóstico.

A continuación, intentamos desafiar nuestro método para detectar tumores a partir de muestras de biopsias humanas. Como primer paso, realizamos un análisis RT-FDC en células aisladas de 13 muestras de biopsia criopreservadas de cáncer colorrectal y 13 muestras de tejido circundante sano de los mismos pacientes. La PCA se realizó en 45 parámetros (Fig. 5a y Fig. 5 complementaria) con el 41,7% de la varianza explicada por los dos componentes principales (25,3% y 16,4% para PC1 y PC2, respectivamente); La selección de los parámetros RT-FDC se optimizó para obtener una buena separación entre el tejido sano y el tumoral. El PCA mostró que las muestras tumorales y sanas se segregaban bien a lo largo de PC2, principalmente por la deformación y la desviación estándar del brillo de células mayores a 100 µm2 (Fig. 5a). Los parámetros de tamaño celular de células inferiores a 100 µm2 también contribuyeron a la separación de las muestras. La exclusión del parámetro más importante (deformación de células de más de 100 µm2) resultó en una peor separación entre muestras sanas y tumorales (Figura complementaria 6). La regresión logística se realizó en el PCA (que se muestra mediante la división lineal en el gráfico de PCA) y se usó para predecir la clasificación de seis muestras ciegas (que se muestran como cruces en la Fig. 5a); las seis muestras se clasificaron correctamente como tejido sano o tumoral, respectivamente. Examinamos la cantidad mínima de células necesarias para la clasificación correcta de estas muestras ciegas (Figura complementaria 7). Se tuvieron que analizar aproximadamente 1.500 células de una muestra para una clasificación correcta, lo que corresponde a un tiempo de medición RT-FDC de aproximadamente 5 minutos.

En los gráficos de PCA de la izquierda, cada punto verde representa una muestra de tumor de un paciente; Los puntos violetas representan el tejido circundante sano correspondiente del mismo paciente. Se realizó una regresión logística en cada uno de los PCA y las dos categorías resultantes se muestran con colores de fondo violeta (saludable) y verde (tumoral). Los cruces representan experimentos ciegos utilizados para la validación del modelo entrenado. El análisis de importancia de características a la derecha del gráfico PCA muestra el significado codificado por colores de cada característica para determinar PC1 y PC2 para ese tejido en particular; el eje x enumera las categorías de tamaño de celda; el eje y enumera los parámetros RT-FDC y sus características estadísticas derivadas de las celdas en la categoría de tamaño correspondiente (entre paréntesis). dt, desviación estándar. a, PCA de los parámetros RT-FDC de 32 muestras de colon congeladas (16 biopsias de tumores y 16 muestras de tejido circundante sano; n = 16 muestras biológicamente independientes en 16 experimentos independientes). b, PCA de los parámetros RT-FDC de 28 muestras frescas de biopsia de colon (14 tumorales, 14 sanas; n = 14 muestras biológicamente independientes en 14 experimentos independientes). c, PCA de los parámetros RT-FDC de 18 muestras de biopsia de pulmón fresco (9 tumorales, 9 sanas; n = 9 muestras biológicamente independientes en 9 experimentos independientes).

El corto tiempo combinado de procesamiento y análisis (<30 min) y los resultados positivos obtenidos en secciones de biopsia de tejido congelado sugieren el uso del método para patología intraoperatoria: el examen de la muestra de biopsia de un paciente durante la cirugía. Para explorar si incluso se podría omitir el paso de congelación, analizamos biopsias recién extirpadas de pacientes con cáncer colorrectal (N = 14). El algoritmo entrenado en tejido de colon congelado no funcionó bien para el tejido fresco, posiblemente debido a diferencias de fenotipo físico entre el tejido congelado y el fresco (Datos ampliados, figura 5). Por lo tanto, se realizó una nueva PCA con datos de biopsias frescas de colon en dos categorías de tamaño (20–50 y 50–600 µm2) (Fig. 5b), donde el 68,5% de la varianza se explicó por los dos componentes principales (36,5% y 32% para PC1 y PC2, respectivamente). Aquí, la deformación de las células contribuyó fuertemente en el PCA y el tamaño de las células fue menos importante que los otros parámetros físicos del fenotipo. Tras la regresión logística, solo 3 de 22 muestras utilizadas para PCA y 1 de 6 de las muestras ciegas no se clasificaron correctamente, lo que podría atribuirse a la heterogeneidad intertumoral o intratumoral. Sin embargo, al utilizar nuestro enfoque en muestras ciegas, logramos una precisión del 100 % en la clasificación de muestras sanas y tumorales de biopsias congeladas, y una precisión del 83 % para muestras de biopsias frescas.

Para validar nuestro método en tejido de un órgano diferente, lo aplicamos a muestras de biopsia de pulmón recién extirpadas de nueve pacientes con cáncer. La PCA combinada con la regresión logística separó fácilmente siete muestras sanas de siete tumorales y otras cuatro muestras ciegas se clasificaron correctamente (Fig. 5c). En el PCA, el 46,9% de la varianza fue explicado por el PC1 y el PC2 (31,2% y 15,7%, respectivamente). Los parámetros de deformación contribuyeron en gran medida a PC1, lo que demuestra nuevamente que la información única aportada por la medición de la deformabilidad celular es útil para distinguir entre tejido tumoral y sano.

También probamos la sensibilidad de nuestro enfoque a la situación en la que solo unas pocas células cancerosas están presentes (tumores con baja celularidad tumoral y un extenso contenido de estroma tumoral desmoplásico) o permanecen (tumores después de quimioterapia o radioquimioterapia con remisión casi completa) en las muestras de tejido disponibles. . Este aspecto es especialmente importante para situaciones clínicas en las que se utiliza análisis intraoperatorio para determinar si el margen operatorio está libre de cáncer (las llamadas secciones congeladas), lo que puede resultar particularmente difícil cuando solo hay muy pocas células tumorales presentes. Realizamos un experimento en el que analizamos una mezcla de muestras frescas de tumor y tejido pulmonar sano en diferentes proporciones (Figura complementaria 8). Una muestra compuesta por un 50% de tejido sano y un 50% de tejido tumoral se clasificó como muestra tumoral. Por supuesto, no todo el tejido tumoral está formado por células cancerosas, por lo que la sensibilidad real para detectar células cancerosas es mayor de lo que parece aquí. De hecho, algunas de las muestras de tumores de colon tenían un contenido estromal relativamente alto. En los casos extremos (Tabla complementaria 5, muestras de tejido de colon congeladas 7 y 11), el contenido estromal fue del 98% y del 80%, lo que significa que los pacientes casi no tenían tumor residual después de la radioquimioterapia neoadyuvante. Aún así, estas muestras se clasificaron correctamente como tumor. Este resultado es notable ya que señala una posible solución al problema de muestreo presente en el análisis histopatológico convencional, especialmente en escenarios de sección congelada. El resultado de esto último depende en gran medida de si el patólogo inspecciona y selecciona la ubicación correcta del tejido donde todavía hay células cancerosas. Debido a limitaciones de tiempo y técnicas de preparación de portaobjetos en escenarios de sección congelada, solo se puede visualizar una pequeña fracción de la muestra total de tejido resecado. Si la disociación del tejido en células individuales y el análisis de un subconjunto aleatorio de éstas pueden detectar con sensibilidad la presencia de tan solo el 20 % (o incluso el 2 %) de células cancerosas presentes en una muestra de tejido determinada, esto sería un claro avance sobre el estado del arte. Se necesita una investigación más específica para establecer esto firmemente. Finalmente, nuestro método también puede detectar cáncer de bajo grado, donde se espera que cualquier diferencia en los parámetros físicos sea más difícil de detectar que en el cáncer de alto grado. La gran mayoría de las muestras analizadas fueron G2 (moderadamente diferenciadas) o G3 (pobremente diferenciadas/indiferenciadas, a menudo también denominadas "alto grado"; Tablas complementarias 5 a 10). En el conjunto de datos de tejido pulmonar, una de las muestras se clasificó como G1 de grado más bajo (bien diferenciada; Tabla complementaria 10). Por tanto, el método no se limita al cáncer de alto grado.

Hemos mostrado un método rápido y sencillo para el procesamiento y análisis de células de tejido sólido, adecuado para el diagnóstico basado en biopsias. A la disociación mecánica del tejido le sigue un análisis de alto rendimiento de las células en el flujo deformacional. En unos pocos minutos, se obtienen imágenes de miles de células y se extraen varias características fenotípicas físicas de cada imagen celular. El método no tiene etiquetas y se basa simplemente en imágenes de campo claro, a diferencia de las herramientas de diagnóstico molecular o la citometría de flujo convencional, donde se necesitan reactivos costosos o marcadores fluorescentes. Es importante destacar que la información está disponible dentro de los 30 minutos posteriores a la escisión de la biopsia, lo que puede ser una ventaja cuando es necesario detectar patología rápidamente. Este es el caso durante la consulta intraoperatoria, que proporciona información de diagnóstico durante la cirugía del cáncer y, a menudo, define el curso posterior del procedimiento. El flujo de trabajo estándar requiere el transporte de la muestra de biopsia al departamento de patología, donde se incluye en un medio de montaje (compuesto de temperatura de corte óptima), se congela y se corta en rodajas finas mediante un criostato. Luego, los portaobjetos se preparan con tinción H&E y los patólogos evalúan numerosas características, incluida la naturaleza de la lesión (es decir, su malignidad) utilizando un microscopio30,50. Nuestro flujo de trabajo evita los pasos de congelación y tinción, podría realizarse directamente en el sitio y permite detectar enfermedades malignas sobre la base de la evaluación automatizada de los parámetros físicos de células individuales.

Más allá del diagnóstico intraoperatorio, demostramos que el método es útil para el examen rápido de muestras de EII. El diagnóstico clínico de la EII requiere en la mayoría de los casos de la combinación de diferentes pruebas, entre ellas análisis de sangre, examen de heces, endoscopia y análisis histológico de biopsias de mucosas51,52. La puntuación histológica tiene una importancia creciente en la EII, ya que el nivel histológico de inflamación se correlaciona con la recurrencia de la enfermedad, la probabilidad de cirugía y el riesgo de cáncer. Mostramos que el grado de inflamación del tejido en una muestra de biopsia de colon se puede obtener monitoreando el fenotipo físico de las células mediante RT-FDC, evitando la necesidad de tinción o evaluación de expertos. Prevemos que el método podría usarse para monitorear los cambios inflamatorios temporales para evaluar la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento, y para proporcionar un sistema de puntuación de diagnóstico objetivo para la práctica clínica diaria, que actualmente falta para la EII.

Estudios anteriores sobre células cancerosas han demostrado una fuerte correlación entre la malignidad y las propiedades mecánicas de las células10,11,12,46,49,53. Aquí explotamos esta correlación para detectar malignidad en biopsias de tejido humano. RT-FDC investiga la deformabilidad celular, a una tasa de alto rendimiento, exponiendo las células a un flujo de corte en un canal de microfluidos; y permite el fenotipado mecánico de células individuales, utilizando un modelo analítico y simulaciones numéricas54,55. Suponiendo una celda esférica inicial en condiciones normales (libres de estrés), RT-FDC puede proporcionar un módulo elástico como medida cuantitativa de la rigidez de la celda. Sin embargo, en muestras de tejido heterogéneas, como las utilizadas en este estudio, las células a menudo no son esféricas antes de ingresar al canal de microfluidos y no se puede obtener un módulo elástico. Sin embargo, el grado de deformación en este ensayo de deformación estándar puede interpretarse como una medida cualitativa de deformabilidad y la información de deformación inherente a las imágenes demuestra ser un marcador de diagnóstico valioso. La PCA de muestras de colon murino y biopsias colorrectales humanas reveló que la deformación celular en condiciones de flujo de canal estandarizadas es clave para distinguir entre tejido sano y tumoral en los tipos de biopsia examinados. Esto pone de relieve la singularidad de la información aportada por este método, que actualmente falta en las prácticas de diagnóstico de rutina que, hasta ahora, se basan principalmente en la evaluación histológica. Tras este estudio de prueba de concepto, será necesario investigar si el método puede adaptarse a diferentes tipos de cáncer o tejido. Esperamos que los cambios en la deformabilidad celular se manifiesten más en ciertos tipos de cáncer que en otros. Puede haber ciertas áreas de aplicación donde el método tenga potencial para mejorar la práctica de diagnóstico.

Para uso clínico práctico, será beneficioso integrar el procesamiento de tejidos y el análisis del fenotipo unicelular en un único proceso automatizado. Aunque la disociación mecánica utilizando un TG es una forma eficaz de obtener células individuales de tejidos para aplicaciones de diagnóstico, será importante reducir los pasos de manipulación manual, como el filtrado y la concentración de células. Sin embargo, incluso en su estado actual, es más rápido y rentable que el procesamiento enzimático de tejido. Una ventaja clave de la disociación mecánica fue que el tiempo de procesamiento tomó menos de 5 minutos por muestra, a diferencia de decenas de minutos o incluso varias horas para los protocolos de disociación enzimática. Además, los protocolos enzimáticos suelen requerir reactivos que dependen de la muestra y que a menudo son costosos y requieren condiciones de almacenamiento especiales, mientras que la disociación mecánica se puede realizar en un medio de cultivo estándar. Aunque diferentes protocolos enzimáticos a menudo enriquecen para tipos de células específicos56, creemos que la suspensión unicelular procedente de la disociación mecánica podría ser más representativa de las poblaciones reales en el tejido y que, por lo tanto, es adecuada para un examen imparcial del paisaje celular. La disociación rápida también tiene el potencial de preservar las propiedades bioquímicas y biofísicas de las células en un estado cercano al in situ; Es probable que estas propiedades se deterioren con tiempos de procesamiento más prolongados en otros enfoques. Debido a la velocidad de la disociación mecánica, las células podrían sufrir menos cambios proteómicos o transcripcionales, que se sabe que ocurren durante el procesamiento enzimático34,57,58,59,60. Se necesitan más estudios comparativos y moleculares para evaluar estos supuestos.

En el futuro, las investigaciones en cohortes de pacientes más grandes permitirán aprovechar el aprendizaje automático para la toma de decisiones de diagnóstico o pronóstico. La inteligencia artificial ya está ayudando a los patólogos a inspeccionar imágenes histológicas de portaobjetos completos, diagnosticar cáncer o clasificar tumores61,62,63. Los grandes conjuntos de datos obtenidos mediante el análisis RT-FDC, compuestos por miles de imágenes celulares e información multidimensional, se prestan para tales enfoques de inteligencia artificial. En este estudio, nos centramos en los parámetros calculados a partir de imágenes en tiempo real, pero se pueden calcular parámetros de fenotipo físico adicionales después de la adquisición y utilizarlos como entradas adicionales para el aprendizaje automático, como las características de forma o textura. El trabajo futuro también se centrará en la correlación entre los datos del fenotipo físico y la puntuación de malignidad del tumor, el potencial metastásico y la tasa de supervivencia.

Finalmente, un aspecto importante del método es que el fenotipo físico de las células se puede utilizar para identificar poblaciones de células en el tejido, ya sea de manera totalmente libre de etiquetas o de forma sinérgica con marcadores moleculares, mejorando las mediciones de fluorescencia. Además, debido a la modalidad de clasificación recientemente agregada a RT-FDC36, se puede aislar una población específica de células de acuerdo con parámetros calculados a partir de imágenes en tiempo real o utilizando redes neuronales entrenadas64,65. Esto podría emplearse para el enriquecimiento de poblaciones de células no caracterizadas en tejidos para análisis ómicos posteriores o incluso con fines de medicina regenerativa, como el aislamiento sin etiquetas de células madre derivadas de tejidos.

En general, nuestros hallazgos muestran que el fenotipado físico de las células mediante RT-FDC después de la disociación mecánica del tejido sin enzimas es un método rápido y simple que puede usarse para diagnosticar estados patológicos en biopsias de tejido. En particular, puede proporcionar una predicción rápida e imparcial del estado de la enfermedad en condiciones inflamatorias y malignas.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en colaboración con el Departamento de Medicina Interna 1, Hospital Universitario de Erlangen, de conformidad con todas las pautas institucionales y éticas, y cubiertos por las licencias de animales apropiadas (Tierversuchsantrag no. 55.2.2-2532-2-1032/55.2. 2-2532-2-473). Los estudios con animales se realizaron emparejados por género y edad utilizando compañeros de camada para cada experimento. Se utilizaron animales tanto machos como hembras. Todos los ratones se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos. Los ratones fueron examinados rutinariamente para detectar patógenos de acuerdo con las pautas de la Federación Europea de Asociaciones Científicas de Animales de Laboratorio. Los ratones se alojaron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h, a 20-23 °C y 40-60% de humedad. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Gobierno del Estado de Franconia Media. Los animales fueron sacrificados mediante dislocación cervical y los órganos fueron extirpados quirúrgicamente. Para comparar el procesamiento enzimático y de TG, se utilizaron ratones C57BL/6J hembras y machos, de 8 a 19 semanas de edad. La perfusión de los tejidos pulmonar y hepático precedió al proceso de disociación enzimática. Para la disociación mecánica usando un TG, los órganos se lavaron minuciosamente con solución tampón fosfato (PBS) antes de colocarlos en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 2% y se colocaron en hielo hasta su procesamiento posterior. Los protocolos enzimáticos se obtuvieron de la literatura y se resumen en la Tabla complementaria 1. Tanto para los protocolos enzimáticos como para los TG, se registró el peso del tejido utilizado. Al final del procedimiento de disociación, se contó el rendimiento celular total utilizando un contador de células LUNA.

Los ratones Rag1-/- inmunodeficientes recibieron 1 millón de células T CD4+ CD25- mediante inyección intraperitoneal. Se aislaron células mononucleares del bazo de ratones donantes C57/BL6 y se purificaron utilizando tecnología de clasificación de células activadas magnéticamente, antes de inyectarlas en ratones inmunodeficientes como se describió anteriormente66,67. Los animales se sacrificaron 3 semanas después de la transferencia celular y el tejido del colon se procesó como se describe en la sección "Disociación de tejidos y preparación unicelular".

Para generar una eliminación específica de una proteína específica de las células epiteliales intestinales con un papel clave para la integridad epitelial, se cruzaron ratones que portaban LoxP-Cre flanqueado por la proteína específica con ratones VillinCre. Se observó tumorigénesis espontánea en colon con penetrancia del 100%.

Las muestras de biopsia humana resecada quirúrgicamente (obtenidas del Instituto de Patología de Erlangen) de tumor o tejido sano se colocaron inmediatamente en medio DMEM avanzado suplementado con 10 % de FBS, 1 % de GlutMAX, 1 % de HEPES y 1 % de penicilina/estreptomicina y se almacenaron a 4 °C. C, procesado inmediatamente o congelado en nitrógeno líquido para su uso posterior. Se analizaron pares de muestras coincidentes, con dos muestras derivadas de cada paciente: una muestra de tumor y una muestra de control procedente del tejido sano que rodea el tumor.

Las muestras de biopsia no se recolectaron específicamente para este estudio de investigación, sino que formaron parte de las prácticas estándar de atención al paciente. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes que proporcionaron muestras y todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la declaración de Helsinki. El protocolo para la obtención de muestras de biopsia humana para este estudio fue aprobado mediante votos éticos del Hospital Universitario de la Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nürnberg (24 de enero de 2005, 18 de enero de 2012; Junta de Revisión Institucional del Hospital Universitario de la Universidad Friedrich-Alexander Número de autorización Erlangen-Nürnberg: Re.-No. 4607).

Las tablas complementarias 5 a 10 presentan las características de la población y la información patológica de todas las muestras humanas analizadas. Los patólogos calificaron el tumor estromal que infiltraba los linfocitos y el contenido del estroma de los tumores como se describió anteriormente68.

Se realizó la disociación del tejido utilizando un TG (Fast Forward Discoveries GmbH), como se describe en las refs. 34,35. Brevemente, la muestra de tejido se cortó en pequeños trozos de aproximadamente 1 a 2 mm y se colocó en la unidad del rotor del TG con 800 µl de DMEM suplementado con FBS al 2%. La unidad de rotor se colocó en la tapa de un tubo Falcon de 50 ml; El inserto del estator con un filtro de celda de 100 μm se colocó encima de la unidad del rotor. Se colocó un tubo Falcon de 50 ml sobre la tapa, se atornilló y se colocó en el dispositivo TG (Fig. 1). Los parámetros del proceso de trituración para cada tipo de tejido se resumen en la Tabla complementaria 2. El fabricante proporcionó los protocolos de TG con algunas modificaciones menores34,35. Después del procedimiento de molienda, el tubo Falcon se invirtió sobre una rejilla, se abrió y el filtro celular se lavó con 5 ml de DMEM, FBS al 2%. El flujo se transfirió a un tubo Falcon de 15 ml y se centrifugó durante 8 minutos a 300 g. Posteriormente, se aspiró el sobrenadante y el sedimento celular se lavó con 2 ml de PBS, FBS al 2%, se pasó a través de un tubo de fondo redondo de citometría de flujo con una tapa de filtro celular y se centrifugó a 300 g durante 5 minutos. El sedimento celular se resuspendió en el tampón de medición de alta viscosidad preparado con metilcelulosa al 0,6% (peso/peso) (4000 cPs; Alfa Aesar) diluida en PBS sin calcio ni magnesio, ajustada a una osmolalidad de 270–290 mOsm kg-1. y pH 7,4. La viscosidad del tampón se ajustó a (25 ± 0,5) mPa s-1 a 24 °C usando un viscosímetro (HAAKE Falling Ball Viscometer Type C, Thermo Fisher Scientific).

Las mediciones de RT-FDC se realizaron como se describió anteriormente13,14, utilizando un instrumento AcCellerator (Zellmechanik Dresden GmbH). La suspensión celular se introdujo en una jeringa Luer-Lok de 1 ml (BD Biosciences) conectada a una bomba de jeringa y conectada mediante un tubo PEEK (IDEX Health & Science LLC) a un chip de microfluidos hecho de polidimetilsiloxano adherido a un cubreobjetos. Se adjuntó al chip una segunda jeringa llena con tampón de medición puro y se usó para enfocar hidrodinámicamente las células dentro del canal de constricción. El chip de microfluidos constaba de una entrada de muestra, una entrada de vaina y una salida conectadas por un estrechamiento de canal central de una sección transversal cuadrada de 20 × 20, 30 × 30 o 40 × 40 μm y una longitud de 300 μm. Los caudales totales correspondientes utilizados fueron: 0,06 µl s para canales de 20 µm-1, 0,12 µl s-1 para canales de 30 µm y 0,2 µl s-1 para canales de 40 µm. La relación de flujo entre vaina y muestra fue de 3:1. El chip se montó en la platina de un microscopio invertido de alta velocidad equipado con una cámara semiconductora complementaria de óxido metálico de alta velocidad. La potencia del láser para cada fluoróforo se ajustó en consecuencia, basándose en controles de tinción única y una muestra sin teñir. Se capturó una imagen de cada celda en una región de interés de 250 × 80 píxeles a una velocidad de fotogramas de 2000 fps. Los parámetros morfológicos, mecánicos y de fluorescencia se adquirieron en tiempo real. El umbral de fluorescencia para cada anticuerpo se ajustó de acuerdo con una muestra de células sin teñir obtenida del mismo tejido. La Tabla complementaria 3 enumera las características adquiridas en tiempo real y durante el análisis posterior al procesamiento; descrito en detalle en publicaciones anteriores69,70. Los datos se adquirieron utilizando el software ShapeIn (ShapeIn2; Zellmechanik Dresden GmbH).

Cuando fue necesario, se incubaron suspensiones unicelulares durante 20 minutos a temperatura ambiente con 200 µl de los anticuerpos correspondientes (para la dilución de anticuerpos, consulte la Tabla complementaria 4) diluidos en PBS suplementado con albúmina sérica bovina al 0,5% (Sigma-Aldrich) y bloqueo del receptor Fc. reactivo de la especie correspondiente (Miltenyi Biotec, humano: 130-059-901; ratón: 130-092-575). Los anticuerpos se lavaron añadiendo 1 ml de PBS y FBS al 2% y se centrifugaron durante 500 g durante 5 minutos. Luego, la preparación celular final se resuspendió en el tampón de medición antes de cargarla en el chip de microfluidos para el análisis RT-FDC. Para muestras de biopsia congeladas, el tejido se colocó en DMEM precalentado, se complementó con FBS al 10 % durante 10 minutos y se dejó descongelar antes de procesarlo como se describió anteriormente.

Los datos RT-FDC se analizaron utilizando paquetes públicos en Python 3.7. Se utilizó la biblioteca Dclab 0.32.3 para la carga inicial, el preprocesamiento y el filtrado de los datos71. Para eliminar imágenes de desechos, células dañadas y glóbulos rojos, aplicamos puertas para un área de sección transversal mínima (20 µm2), una relación de área (1:1,1) y una relación de aspecto (1:2). Se identificaron células pequeñas <60 µm2 mediante selección adicional para una relación de área de 1:1,05 y una relación de aspecto de 1:2. Cualquier evento fuera de estas puertas y todos los eventos <25 µm2 se consideraron desechos. En los diagramas de dispersión de los parámetros RT-FDC, la codificación de colores se basa en estimaciones de densidad del núcleo normalizadas entre 0 y 1.

El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete SciPy 1.3.0. Se utilizó la prueba de rangos con signos de Wilcoxon para evaluar muestras pareadas (muestras murinas sanas versus muestras tumorales y muestras de tejido de colon fresco humano versus muestras congeladas). Se aplicó la prueba U de Mann-Whitney a los datos de colitis de transferencia. En los gráficos, los valores de P están representados por * P < 0,05, ** P < 0,01 y *** P < 0,001. Los tamaños del efecto se calcularon como r = |z|/√N, donde z es el estadístico z de la prueba y N es el número de muestras. Los tamaños del efecto se juzgaron según los criterios de Cohen de la siguiente manera: 0,1–0,3 efecto pequeño, 0,3–0,5 efecto moderado y >0,5 efecto grande. Se realizó la correlación de Pearson para juzgar la correlación entre la deformación celular y el número de células CD45+ y la correlación entre el tamaño celular y el área de muestras murinas sanas y tumorales.

Se utilizó el paquete Scikit learn 0.23.2 para un mayor procesamiento y análisis de datos72. Los parámetros obtenidos de RT-FDC se transformaron escalando cada característica al rango entre 0 y 1. Se utilizó PCA para la reducción de dimensionalidad lineal, utilizando descomposición en valores singulares de los datos para proyectarlos en un espacio bidimensional (PC1 versus PC2). Se utilizó la regresión logística para la clasificación de muestras sanas frente a muestras tumorales.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos RT-FDC generados y analizados para las Figs. 2 a 5 y datos ampliados Figs. 3 a 5 están disponibles en el repositorio abierto de citometría de deformabilidad (https://dcor.mpl.mpg.de/organization/soteriou-kubankova)73. Los identificadores individuales para cada conjunto de datos se proporcionan en la Tabla complementaria 11. Los datos de origen para la Figura 1 de datos ampliados también se proporcionan con este documento. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código Python para el procesamiento y visualización de datos RT-FDC está disponible en https://github.com/marketakub/physical_phenotyping_tissues.

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Agradecemos a R. Grützmann y K. Bende (Universitätsklinikum Erlangen) por ayudarnos amablemente con las muestras de biopsia. También agradecemos a J. Kayser y M. Urbanska por una revisión crítica del artículo. Agradecemos el apoyo financiero de la DFG (SFB/TRR241 'IBDome' a R.LP., MW, RA y MN; FOR2438 a MN; DI 1537/20-1, DI 1537/22-1, SFB CRC1181 y SFB TR221 a JD), el IZKF Erlangen (subvención de investigación A79 para JD y el programa de científico clínico paso 2 para ME) y financiación central de la Sociedad Max Planck (para JG).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Sociedad Max Planck.

Estos autores contribuyeron igualmente: Despina Soteriou, Markéta Kubánková.

Instituto Max Planck para la Ciencia de la Luz y Centro Max Planck de Física y Medicina, Erlangen, Alemania

Despina Soteriou, Markéta Kubánková, Christine Schweitzer y Jochen Guck

Departamento de Medicina 1: Gastroenterología, Neumología y Endocrinología, Universidad Friedrich-Alexander de Erlangen-Nürnberg (FAU) y Hospital Universitario de Erlangen, Erlangen, Alemania

Dew Lopez-Inns, Rashmita Pradhan, Oana-Maria Thoma, Maximilian Waldner, Raja Atreya y Markus F. Neurath

Centro Alemán de Inmunoterapia (DZI), Universidad Friedrich-Alexander de Erlangen-Nuremberg (FAU) y Hospital Universitario de Erlangen, Erlangen, Alemania

Dew Lopez-Posadas, Rashmita Pradhan, Oana-Maria Thoma, Andrea-Hermina Györfi, Alexandru-Emil Matei, Maximilian Waldner, George HW Distler, Raja Atreya y Markus F. Neurath

Centro Integral del Cáncer Erlangen-EMN (CCC ER-EMN), Erlangen, Alemania

Oana-Maria Thoma, Maximilian Waldner, Markus Eckstein, Regine Schneider-Stock, Raja Atreya, Markus F. Neurath y Arndt Hartmann

Departamento de Medicina Interna 3: Reumatología e Inmunología, Universidad Friedrich-Alexander de Erlangen-Nürnberg (FAU) y Hospital Universitario de Erlangen, Erlangen, Alemania

Andrea-Hermina Györfi, Alexandru-Emil Matei y Jörg HW Distler

Tecnologías sanitarias clínicas, Fraunhofer IPA, Mannheim, Alemania

Stefan Scheuermann y Jens Langejürgen

Instituto de Patología, Hospital Universitario, Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg (FAU), Erlangen, Alemania

Markus Eckstein, Regine Schneider-Stock y Arndt Hartmann

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MK, DS y JG concibieron el estudio y gestionaron el progreso del proyecto. DS y MK coordinaron los experimentos y análisis. DS desarrolló protocolos experimentales y realizó experimentos junto con CS. MK realizó el análisis y visualización de datos. Otros autores ayudaron con los experimentos y participaron en discusiones críticas. MK y DS escribieron el artículo y todos los autores brindaron comentarios.

Correspondencia a Jochen Guck.

SS, JL y JG son cofundadores de la empresa Fast Forward Discoveries GmbH, que comercializa la tecnología TG. DS, MK y JG son nombrados inventores en una solicitud de patente para la combinación de TG y RT-DC para el diagnóstico de biopsia sólida. MK y JG son cofundadores de la empresa Rivercyte GmbH, que comercializa aplicaciones de diagnóstico de citometría de deformabilidad. Los demás autores no declaran tener intereses en conflicto.

Nature Biomedical Engineering agradece a Dino Di Carlo, Per Uhlen y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a,b, Porcentaje de células viables para diferentes órganos disociadas usando un triturador de tejidos (TG; marcado en rojo) o disociación estándar (marcada en azul). La viabilidad celular se evaluó utilizando (a) yoduro de propidio y RT-FDC y (b) ensayo de exclusión de azul tripano. c, Número de células (obtenidas utilizando un dispositivo contador de células) por mg de tejido procesado. Los pulmones, hígado, riñón, páncreas y estómago procesados ​​con disociación enzimática no fueron pesados ​​antes de los experimentos. La línea representa la media y el cuadro se extiende desde los valores mínimos hasta los máximos. datos de TG riñón y bazo: n = 5, todos los demás órganos n = 5; para disociación enzimática riñón, páncreas, estómago: n = 3; todos los demás órganos n = 4; repeticiones biológicamente independientes realizadas como experimentos independientes).

Datos fuente

a, Gráficos de dispersión representativos de intensidades de fluorescencia en tres canales de detección diferentes de RT-FDC, que muestran la posibilidad de utilizar marcadores fluorescentes de la superficie celular para caracterizar las células. Los gráficos muestran la expresión de un marcador endotelial (CD31-PE) frente a un marcador de leucocitos (CD45-FITC); y un marcador epitelial (EpCAM-APC) frente a CD45-FITC. b, imágenes representativas de células y sus correspondientes rastros de fluorescencia; la forma temporal del pico de fluorescencia corresponde a la localización subcelular del fluoróforo. Arriba de izquierda a derecha: células negativas para todos los marcadores, una célula positiva para CD45; abajo de izquierda a derecha: células positivas solo para EpCAM y células positivas solo para CD31.

Gráficos de dispersión representativos de la relación de aspecto frente al tamaño celular de células aisladas de murino a, timo, c, bazo y e, riñón que muestran la estrategia de activación para identificar dobletes celulares. Dobletes celulares identificados en b, timo y d, bazo y f, riñón con los correspondientes rastros de fluorescencia (b,d), que muestran un leucocito (CD45) unido a una célula endotelial (CD31), o (f) la interacción de dos leucocitos.

a, Gráficos de dispersión de deformación versus tamaño celular para células aisladas de tejido de hígado de ratón usando un triturador de tejidos (TG) o disociación enzimática, que muestran el enriquecimiento de los hepatocitos después de la disociación mecánica para 3 repeticiones biológicas independientes. b, Diagrama de dispersión de deformación versus tamaño celular que muestra 3 grupos de células que corresponden a hepatocitos de diferentes tamaños; con el correspondiente gráfico de estimación de densidad del núcleo (KDE) e imágenes representativas (r = radio de celdas). c, Porcentaje de hepatocitos respecto del número total de células hepáticas, detectado por RT-DC para cinco repeticiones biológicas independientes. d, Gráficos de dispersión de deformación versus tamaño celular para células aisladas de tejido pulmonar de ratón usando un triturador de tejidos o disociación enzimática para 3 repeticiones biológicas independientes.

Gráficos de dispersión de tamaño celular versus deformación de células individuales extraídas de muestras de biopsia de colon frescas (púrpura) o congeladas (verde); una muestra sana; b, muestra de tumor; incluyendo 3 imágenes de células representativas para cada parcela con una barra de escala = 10 μm2. Los gráficos de estimación de densidad del núcleo (KDE) de la derecha corresponden a los gráficos de dispersión de la izquierda; los histogramas muestran las distribuciones de tamaño y deformación de las células. c, Medianas y desviaciones estándar del tamaño de celda, deformación, relación de área y relación de aspecto de muestras frescas (N = 6) y congeladas correspondientes (N = 6). Los cuadros se extienden desde el percentil 25 al 75 con una línea en la mediana; los bigotes abarcan 1,5 veces el rango intercuartil. Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando una prueba de rangos con signo de Wilcoxon bilateral, tamaño de celda de desviación estándar (*p = 0,0277, r = 0,64), índice de área de mediana (*p = 0,0277, r = 0,64) y índice de área de desviación estándar (*p = 0,0277,r = 0,64); r: tamaño del efecto; NS: no significativo.

Figuras, tablas y referencias.

Datos fuente.

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Reimpresiones y permisos

Soteriou, D., Kubánková, M., Schweitzer, C. et al. Fenotipado físico unicelular rápido de biopsias de tejido disociadas mecánicamente. Nat. Biomédica. Ing (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01015-3

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Recibido: 01 de diciembre de 2021

Aceptado: 22 de febrero de 2023

Publicado: 06 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01015-3

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